沈熠，莫巖君，于天源，呂桃桃，羅宇婷，張羽墨，邵帥，李易真

北京中醫(yī)藥大學(xué)，北京市 100029

坐骨神經(jīng)及其分支與小腿、足的運動和感覺密切相關(guān)。坐骨神經(jīng)損傷后，癥狀以臀部疼痛并向下肢放射，下肢無力、肌肉萎縮，自覺麻木、疼痛[1]，感覺異常為主，臨床可采用肌電圖和神經(jīng)傳導(dǎo)速度進(jìn)行診斷和療效評估[2]，可通過促進(jìn)坐骨神經(jīng)修復(fù)的藥物治療、物理治療和手術(shù)治療進(jìn)行干預(yù)。坐骨神經(jīng)損傷作為周圍神經(jīng)損傷的一種，其恢復(fù)機理尚不完全明確，亟需從多角度完善其機理并指導(dǎo)臨床。本團(tuán)隊前期研究表明[8-20]，推拿手法干預(yù)坐骨神經(jīng)損傷大鼠可調(diào)控多層面、多因子的表達(dá)，促進(jìn)坐骨神經(jīng)的修復(fù)。

神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白(neuregulins,NRGs)及其受體原癌基因人類表皮生長因子受體(human epidermal growth factor receptor,HER，又名ErbB)家族與神經(jīng)發(fā)育有關(guān)，影響神經(jīng)回路產(chǎn)生、軸突代償、神經(jīng)傳遞和突觸可塑性[3]。周圍神經(jīng)損傷后，此信號與施萬細(xì)胞和髓鞘密切相關(guān)。本研究建立大鼠坐骨神經(jīng)損傷模型，通過斜板測試評價后肢肌力的恢復(fù)情況，通過透射電鏡觀察坐骨神經(jīng)損傷點處髓鞘的變化，通過Western blotting法檢測坐骨神經(jīng)損傷點和L4-6脊髓處NRG1及其受體ErbB2的表達(dá)，分析比較“三法三穴”推拿手法干預(yù)前后的變化，以完善推拿促進(jìn)周圍神經(jīng)損傷恢復(fù)的可能機理。

1 材料與方法

1.1 實驗動物和分組

雄性SPF級Sprague-Dawley大鼠76只，體質(zhì)量(200±10) g，購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司，合格證號為北京百善SCXK(京)2016-0006，飼養(yǎng)于北京中醫(yī)藥大學(xué)屏障環(huán)境動物實驗室，室溫20 ℃，空氣相對濕度40%，大鼠自由進(jìn)食水。實驗程序經(jīng)北京中醫(yī)藥大學(xué)動物使用和管理委員會批準(zhǔn)，符合動物福利與倫理原則。

采用隨機數(shù)字法將大鼠分為正常組、假手術(shù)組、模型組和推拿組。具體方法：使用Microsoft Excel軟件，A列為編號1～76，B列=RAND()并下拉填充，至每個編號都有生成的[0,1]之間一個隨機數(shù)字，C列為復(fù)制數(shù)值并升序排列，每組19只動物，記錄編號和分組。

1.2 主要儀器與試劑

按摩推拿手法模擬儀：中國專利200710187403.1。自制電動斜板測試儀。Mini-P-2電泳槽、電泳儀：美國BⅠO-RAD公司。MultiSkan3酶標(biāo)儀：美國THERMO公司。冷凍離心機：德國EPPENDORF公司。水平脫色搖床：海口其林貝爾有限公司。電動組織勻漿器：美國FLUKA公司。預(yù)制膠溶液：中國新賽美公司。BCA蛋白定量試劑盒、10X TBST緩沖液、彩虹18-245蛋白Marker、脫脂奶粉、2 mg/ml BSA標(biāo)準(zhǔn)品：中國索萊寶公司。兔源ErbB2抗體、HRP二抗、ECL顯影液：英國ABCAM公司。小鼠源NRG1抗體：美國THERMO FⅠSHER公司。戊巴比妥鈉：中國國藥集團(tuán)。戊二醛、鋨酸、環(huán)氧樹脂812、醋酸雙氧鈾、檸檬酸鉛：中國中興百瑞公司。

1.3 造模及干預(yù)方法

1.3.1 造模

模型組和推拿組使用坐骨神經(jīng)夾持損傷法進(jìn)行造模。造模前12 h禁食，器械消毒。1%戊巴比妥鈉溶液3.5 ml/kg腹腔注射麻醉，注意回抽，至疼痛反射消失。備皮并常規(guī)消毒手術(shù)區(qū)域。于大鼠右側(cè)臀股交界處，縱向切口約0.5 cm。眼科剪鈍性分離，以彎鉤鑷找到并暴露、分離坐骨神經(jīng)。使用同一把特制無齒持針器，于梨狀肌下緣5 mm處滿扣夾持5 s后松開，滿扣力量約6 N，最終形成約2 mm寬的神經(jīng)損傷點?？p合后碘伏消毒。術(shù)后注意護(hù)理。假手術(shù)組僅分離后暴露坐骨神經(jīng)5 s，不夾持。

1.3.2 干預(yù)

術(shù)后7 d推拿組開始干預(yù)，干預(yù)前適應(yīng)環(huán)境0.5 h。采用按摩推拿手法模擬儀分別于推拿組術(shù)側(cè)殷門、承山、陽陵泉三穴，先后施行點、撥、揉三法，每法每穴1 min，力量為4 N。每只大鼠干預(yù)9 min，每天1次，每干預(yù)10次休息1次，共干預(yù)20次。其余組束縛同等時長。

1.4 檢測方法

1.4.1 斜板測試

每組取8只大鼠，于造模前、術(shù)后7 d、28 d，在室溫恒定、安靜環(huán)境下進(jìn)行測試。采用自制電動斜板測試儀，使用前校對并歸零電子量角器。大鼠適應(yīng)環(huán)境0.5 h后，將頭朝向斜板遠(yuǎn)離軸端平行放置，待其適應(yīng)后逐漸緩緩抬高斜板，待其發(fā)生相對位移并保持5 s后，記錄此時角度。每只大鼠按次序重復(fù)測量3次，取均數(shù)。

1.4.2 Western blotting

分別于術(shù)后3 d、7 d、28 d，每組取5只大鼠，1%戊巴比妥鈉3.5 ml/kg腹腔注射麻醉后，冰上腹主動脈取血5 ml，后取術(shù)側(cè)坐骨神經(jīng)損傷點上下各1 cm，再取脊髓L4-6節(jié)段。將組織分別放于組織裂解混合液(PMSF、蛋白酶抑制劑、磷酸酶抑制劑，1∶100以RⅠPA稀釋)300 μl中，冰上研磨?；旌弦? ℃、14 000 r/h離心1 h。吸取上清，加5×蛋白上樣緩沖液并混勻。封口后100 ℃水浴5 min，后冰上5 min。BCA比色測吸光度并配平。配膠上樣后穩(wěn)壓電泳120 V 90 min；冰上電轉(zhuǎn)100 V 120 min。依據(jù)marker剪膜，使用5%脫脂奶的TBST溶液室溫?fù)u床1 h進(jìn)行封閉。加一抗(NRG1抗體1∶100，ErBb2抗體1∶1000，β-actin抗體1∶3000)室溫?fù)u床孵育1 h后，4 ℃冰箱過夜。1×TBST洗膜3次，每次10 min。加二抗室溫?fù)u床孵育1 h。洗膜3次。配好顯影液并避光保存，均勻滴在膜上，避光反應(yīng)1 min后開始顯影。

1.4.3 電鏡觀察

術(shù)后28 d，每組取4只大鼠，1%戊巴比妥鈉3.5 ml/kg腹腔注射麻醉后，俯臥于冰中，快速取術(shù)側(cè)坐骨神經(jīng)損傷點上下0.5 cm，3%戊二醛溶液中固定2 h，1%鋨酸溶液固定1.5 h，醋酸雙氧鈾染色1 h，50%～100%酒精梯度脫水，每級15 min。分別用無水酒精和無水丙酮等比例混合液、無水丙酮脫水各10 min。環(huán)氧樹脂包埋，切片厚50～70 nm。鉛染色，電鏡觀察神經(jīng)損傷點，CCD數(shù)碼照相系統(tǒng)采集圖像。應(yīng)用Ⅰmage J軟件測量軸突直徑和有髓纖維總直徑，計算g-ratio。

1.5 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 斜板測試

造模前，各組斜板測試角度無顯著性差異(P＞0.05)。術(shù)后7 d和28 d，模型組和推拿組斜板測試角度均低于正常組和假手術(shù)組(P＜0.05)。術(shù)后28 d，推拿組評分高于模型組(P＜0.05)。正常組和假手術(shù)組在各時間點斜板測試評分比較無顯著性差異(P ＞0.05)。模型組術(shù)后7 d和28 d低于造模前(P＜0.05)，推拿組術(shù)后28 d低于造模前，高于術(shù)后7 d (P＜0.05)。見表1。

2.2 Western blotting

2.2.1 坐骨神經(jīng)損傷點

2.2.1.1 NRG1表達(dá)

術(shù)后3d，模型組和推拿組NRG1表達(dá)高于正常組和假手術(shù)組(P＜0.05)。術(shù)后7 d和28 d，各組NRG1表達(dá)無顯著性差異(P＞0.05)。正常組在各時間點NRG1表達(dá)無顯著性差異(P＞0.05)。假手術(shù)組和推拿組術(shù)后28 d NRG1表達(dá)低于術(shù)后3 d (P＜0.05)；模型組術(shù)后28 d表達(dá)低于術(shù)后3 d和7 d (P＜0.05)。見表2、圖1。

2.2.1.2 ErbB2表達(dá)

術(shù)后3d和7d，模型組和推拿組ErbB2表達(dá)高于正常組和假手術(shù)組(P＜0.05)。術(shù)后28d，各組ErbB2表達(dá)無顯著性差異(P＞0.05)，但推拿組ErbB2表達(dá)高于模型組(P＜0.05)。正常組和假手術(shù)組各時間點ErbB2表達(dá)無顯著性差異(P＞0.05)。模型組術(shù)后28 d ErbB2表達(dá)低于術(shù)后3 d(P＜0.05)；推拿組術(shù)后7d和28dErbB2表達(dá)低于術(shù)后3d (P＜0.05)。見表3、圖1。

表1 各組斜板測試角度比較(°)

表2 各組坐骨神經(jīng)中NRG1平均積分光密度

2.2.2 L4-6脊髓

2.2.2.1 NRG1表達(dá)

術(shù)后3d，模型組和推拿組NRG1表達(dá)高于正常組和假手術(shù)組(P＜0.05)。術(shù)后7d，模型組和推拿組NRG1表達(dá)高于假手術(shù)組(P＜0.05)。術(shù)后28d，各組NRG1表達(dá)無顯著性差異(P＞0.05)，但推拿組NRG1表達(dá)高于模型組(P＜0.05)。正常組、假手術(shù)組和推拿組在各時間點NRG1均無顯著性差異(P＞0.05)。模型組術(shù)后28dNRG1表達(dá)低于術(shù)后3d和7d (P＜0.05)。見表4、圖2。

2.2.2.2 ErbB2表達(dá)

術(shù)后3d和7d，模型組和推拿組ErbB2表達(dá)高于正常組和假手術(shù)組(P＜0.05)。術(shù)后28d，各組間ErbB2表達(dá)比較無顯著性差異(P＞0.05)。各組組內(nèi)各時間點比較也無顯著性差異(P＞0.05)。見表5、圖2。

2.3 電鏡觀察

2.3.1 形態(tài)學(xué)

術(shù)后28d，假手術(shù)組髓鞘致密均勻，結(jié)構(gòu)完整，形態(tài)規(guī)則并呈板層樣結(jié)構(gòu)整齊排列；模型組部分髓鞘軸突可見重度髓鞘崩脫，髓鞘扭曲，偶有髓鞘球，板層間隙擴(kuò)大、板層分離；推拿組髓鞘部分磷脂脫落，板層略有分離，偶見髓鞘崩脫。見圖3。

2.3.2 g-ratio

術(shù)后28d，模型組g-ratio值低于假手術(shù)組(P＜0.05)，推拿組高于模型組(P＜0.05)，且與假手術(shù)組比較無顯著性差異(P＞0.05)。見表6。

表3 各組坐骨神經(jīng)中ErbB2平均積分光密度

表4 各組L4-6脊髓中NRG1平均積分光密度

表5 各組L4-6脊髓中ErbB2平均積分光密度

圖1 術(shù)后各時間點各組坐骨神經(jīng)損傷點中NRG1和ErbB2表達(dá)(Western blotting)

圖2 術(shù)后各時間點各組L4-6脊髓中NRG1、ErbB2表達(dá)(Western blotting)

表6 術(shù)后28d各組g-ratio值

3 討論

周圍神經(jīng)損傷主要表現(xiàn)為運動和感覺功能障礙、肌肉無力和肌肉萎縮，按癥狀可歸于中醫(yī)的痿證和痹證。前者以痿軟無力為主，是功能異常；后者以疼痛麻木為主，是感覺異常[4]。中醫(yī)論治時，以舒筋活絡(luò)、扶正祛邪為要，通過口服外用中藥、針灸推拿等中醫(yī)干預(yù)手段，改善癥狀，減輕肌肉萎縮、無力及疼痛、感覺異常，最終通過促進(jìn)神經(jīng)恢復(fù)、減少細(xì)胞凋亡達(dá)到療效。內(nèi)治以健運脾胃、調(diào)補肝腎、養(yǎng)血行瘀為主[5]。外治主要采用針灸推拿，前者側(cè)重經(jīng)絡(luò)理論上穴位的主治與特性，后者側(cè)重在解剖層面消除病因，其共同點是舒筋通絡(luò)、活血止痛，以期恢復(fù)正常結(jié)構(gòu)與功能。

痹證中“坐臀風(fēng)”(又名腿股風(fēng))癥見臀部疼痛，可連累腰、腿，甚至足跟，這與坐骨神經(jīng)痛癥狀極為相似，其治療側(cè)重放松局部，以膀胱經(jīng)和膽經(jīng)為主，點、拿、按環(huán)跳、委中、承山、陽陵泉[6]。痿證中下肢癥狀的選穴除上述穴位外還有心俞、命門、關(guān)元等穴。本研究根據(jù)經(jīng)絡(luò)和解剖理論選取殷門、承山和陽陵泉三穴，對坐骨神經(jīng)鉗夾損傷大鼠進(jìn)行手法干預(yù)。

推拿干預(yù)在坐骨神經(jīng)損傷后修復(fù)的過程中，從運動[7]和感覺[8]功能恢復(fù)兩個方面起效；在脊髓、背根節(jié)、坐骨神經(jīng)損傷點三個水平，多因子共同發(fā)揮作用。經(jīng)推拿手法干預(yù)，在脊髓水平，脊髓腹角運動神經(jīng)元損傷減輕[9]，軸突再生加快[10]；在背根節(jié)水平，可減少神經(jīng)元變性及腫脹現(xiàn)象[11]；在坐骨神經(jīng)水平，改善神經(jīng)元凋亡[12]，促進(jìn)神經(jīng)纖維髓鞘再生與軸突恢復(fù)[13]。此外，推拿干預(yù)可以調(diào)控多種因子的表達(dá)，促進(jìn)受損周圍神經(jīng)的恢復(fù)。細(xì)胞凋亡相關(guān)的Bcl-2、Caspase-3[7]，與軸突相關(guān)的層黏連蛋白[14]，與髓鞘相關(guān)的髓鞘堿性蛋白[15]，與神經(jīng)細(xì)胞生長增殖相關(guān)的降鈣素基因相關(guān)肽[16]和神經(jīng)生長因子[17]，突觸可塑性相關(guān)的Synapsin Ⅰ[6]，軸漿運輸相關(guān)的馬達(dá)蛋白(Dynein、Kinesin、Dynactin)[18]，神經(jīng)元細(xì)胞骨架相關(guān)的微管相關(guān)蛋白2和神經(jīng)絲蛋白[19]等因子都參與這個過程。

圖3 電鏡觀察結(jié)果

在周圍神經(jīng)系統(tǒng)中，施萬細(xì)胞包繞軸突形成髓鞘，不僅可使電信號跳躍式傳導(dǎo)，亦有營養(yǎng)支持、修復(fù)受損的作用。周圍神經(jīng)損傷后，Wallerian變性發(fā)生，軸突和髓鞘崩解消失。g-ratio值反映髓鞘厚度，數(shù)值越大，髓鞘越薄。正常成年大鼠周圍神經(jīng)此比值為0.6[20]。本研究顯示，術(shù)后28d，假手術(shù)組和推拿組g-ratio值與此值接近，模型組降低，說明坐骨神經(jīng)損傷點處在此時間點超微結(jié)構(gòu)仍顯示髓鞘變厚，推拿干預(yù)可減輕髓鞘變厚程度，更趨近于正常水平。模型組結(jié)果與既往研究[21]不同，其原因可能是術(shù)后28d一部分髓鞘板層仍處于分離狀態(tài)，其間隙仍擴(kuò)大，亦可能是觀察視野距離損傷點遠(yuǎn)近不同所致。本研究還發(fā)現(xiàn)，推拿干預(yù)28 d能促進(jìn)模型動物患側(cè)肢體運動功能恢復(fù)。這與本團(tuán)隊前期大量研究的結(jié)果相同，說明推拿干預(yù)能明顯改善患側(cè)后肢肌力，改善其運動功能。推拿治療坐骨神經(jīng)損傷療效顯著，且有確切形態(tài)學(xué)證據(jù)。

NRGs是一類細(xì)胞生長與分化調(diào)節(jié)相關(guān)蛋白，對神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育起重要作用，可分為NRG1～NRG4，其中NRG1研究最多。NRG1的表皮生長因子(epidermal growth factor,EGF)樣結(jié)構(gòu)可以結(jié)合并激活ErbB受體酪氨酸激酶家族(ErbB1～ErbB4)。ErbB2活化需要ErbB3或ErbB4的參與，形成異源性二聚體，激活下游信號分子發(fā)揮作用[22]。不同類型的NRG1作用亦不同。當(dāng)神經(jīng)損傷后，軸突-施萬細(xì)胞相互作用中斷，軸突跨膜NRG1與膠質(zhì)ErbB受體的相互作用消失，可溶性NRG1轉(zhuǎn)錄被激活[23]。在周圍神經(jīng)系統(tǒng)中，NRG1通過與受體ErbB結(jié)合，調(diào)控施萬細(xì)胞行為，調(diào)控髓鞘再生。輕度損傷(如擠壓傷或切斷傷)后，遠(yuǎn)端神經(jīng)殘端可溶性NRG1表達(dá)立即顯著增加[24]。此信號可調(diào)控神經(jīng)嵴細(xì)胞向施萬細(xì)胞前體分化[25]，并調(diào)控后者的增殖和遷移[26]。外源性NRG1干預(yù)可防止和降低因軸突切斷導(dǎo)致的施萬細(xì)胞凋亡[27]。軸突源性的NRG1Ⅲ與施萬細(xì)胞ErbB2/3受體結(jié)合發(fā)生磷酸化，產(chǎn)生起始信號并激活下游的絲裂原活化蛋白激酶、磷脂酰肌醇3激酶、磷脂酶C、蛋白激酶C等神經(jīng)修復(fù)再生相關(guān)的信號通路，在髓鞘化過程中發(fā)揮作用[23]。除了神經(jīng)修復(fù)作用，NRG1-ErbB信號亦在精神分裂癥[28]、心肌梗死[29]等疾病中通過調(diào)控神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞、心肌細(xì)胞發(fā)揮作用。

在坐骨神經(jīng)損傷點中，模型組和推拿組術(shù)后28d NRG1、ErbB2表達(dá)低于術(shù)后3 d；造模后3 d，模型組和推拿組NRG1、ErbB2表達(dá)高于假手術(shù)組。提示此信號在神經(jīng)損傷早期起效。術(shù)后7d，各組NRG1無顯著性差異，而模型組和推拿組ErbB2表達(dá)升高。這說明ErbB2的高表達(dá)可能與NRG1信號無關(guān)，其原因可能是NRG1通過ErbB3或ErbB4，與ErbB2形成二聚體活化起效，因此推斷在此時間點ErbB2的蛋白表達(dá)可能有一定時間延后性。術(shù)后28d，模型組和推拿組NRG1、ErbB2表達(dá)與正常組和假手術(shù)組比較均無顯著性差異，提示在神經(jīng)損傷后28d，坐骨神經(jīng)水平的NRG1-ErbB2信號已完成其對于損傷神經(jīng)的調(diào)節(jié)。干預(yù)后，推拿組NRG1、ErbB2表達(dá)高于模型組，提示推拿干預(yù)可以一定程度上提高坐骨神經(jīng)中NRG1、ErbB2的表達(dá)。在不同模型和干預(yù)方法的研究中，NRG1、ErbB2亦發(fā)揮相似作用。對于糖尿病周圍神經(jīng)病大鼠，電針干預(yù)14 d可上調(diào)坐骨神經(jīng)NRG1和ErbB2 mRNA表達(dá)，改善坐骨神經(jīng)功能[30]。對于正中神經(jīng)受損小鼠，人為促進(jìn)ErbB2高表達(dá)，能顯著改善握力，促進(jìn)軸突末梢的生長[31]。

在L4-6脊髓中，模型組術(shù)后28d NRG1水平降低，與其在坐骨神經(jīng)損傷點處變化趨勢相同，亦說明推拿干預(yù)可以一定程度上提高脊髓中NRG1表達(dá)；各組術(shù)后3d、7d、28d比較，ErbB2水平均無顯著性差異，其原因可能是NRG1與其他受體結(jié)合。造模后3d和7d，模型組和推拿組NRG1、ErbB2表達(dá)高于假手術(shù)組，提示其與神經(jīng)損傷密切相關(guān)。術(shù)后28d，模型組和推拿組NRG1、ErbB2表達(dá)與假手術(shù)組比較無顯著性差異，提示在坐骨神經(jīng)損傷后28d，脊髓水平的NRG1-ErbB2已完成其對于損傷神經(jīng)的修復(fù)作用。后續(xù)研究可細(xì)分時間和觀察部位，結(jié)合感覺和運動功能的恢復(fù)進(jìn)行分析。值得注意的是，推拿干預(yù)后，推拿組NRG1表達(dá)高于模型組，提示推拿干預(yù)可以提高脊髓NRG1的表達(dá)。在其他研究中也證實脊髓層面NRG1-ErbB2的作用。在脊神經(jīng)結(jié)扎模型中，造模后14d脊髓背角中NRG1表達(dá)升高，與ErbB受體結(jié)合，介導(dǎo)星形膠質(zhì)細(xì)胞活化[32]。在骨癌痛模型大鼠中，造模14d后脊髓背角內(nèi)星形膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞被廣泛激活，阻斷NRG1-ErbB2受體信號通路能有效抑制脊髓膠質(zhì)細(xì)胞的表達(dá)和活化[33]。

綜上所述，坐骨神經(jīng)鉗夾損傷后，NRG1、ErbB2在坐骨神經(jīng)損傷點和L4-6脊髓中表達(dá)升高；推拿干預(yù)可改善模型大鼠的運動功能，調(diào)節(jié)坐骨神經(jīng)損傷點處的髓鞘厚度，調(diào)節(jié)NRG1、ErbB2的表達(dá)量，促進(jìn)受損神經(jīng)的恢復(fù)。

在未來研究中，可以結(jié)合形態(tài)學(xué)、光遺傳和慢病毒轉(zhuǎn)染技術(shù)，研究NRG1-ErbB2通路對脊髓、背根節(jié)、坐骨神經(jīng)損傷點中不同神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的影響和神經(jīng)損傷、修復(fù)相關(guān)細(xì)胞(如巨噬細(xì)胞)的變化，以及中醫(yī)干預(yù)對此通路和相關(guān)神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的影響；亦可過表達(dá)或減低甚至阻斷此通路，對比中醫(yī)干預(yù)，研究其對于內(nèi)源性NRG1、ErbB2的影響。