汪俊宇，龐日朝，王文春，王美玉，向武，趙小華，張安仁

1.中國(guó)人民解放軍西部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院康復(fù)醫(yī)學(xué)科，四川成都市 610083；2.四川大學(xué)生物治療國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川成都市 610041；3.西南財(cái)經(jīng)大學(xué)天府學(xué)院，四川成都市 610052

腸道菌群數(shù)量與哺乳動(dòng)物細(xì)胞之比約為10∶1，其基因組是人類基因組的1000倍[1-3]。這種巨大的微生物網(wǎng)絡(luò)對(duì)細(xì)胞的代謝、食物的消化、營(yíng)養(yǎng)的吸收以及免疫系統(tǒng)調(diào)節(jié)都至關(guān)重要[4-6]。有益的非致病性腸道細(xì)菌被致病性細(xì)菌所取代，使腸道菌群原有的穩(wěn)態(tài)被破壞，表現(xiàn)為腸道菌群失調(diào)。腸道菌群失調(diào)可對(duì)帕金森病、多發(fā)性硬化、阿爾茨海默病、孤獨(dú)癥、肌萎縮側(cè)索硬化等中樞神經(jīng)系統(tǒng)(central nervous system,CNS)疾病的發(fā)生發(fā)展產(chǎn)生影響[7-11]。

動(dòng)物實(shí)驗(yàn)指出[12]，脊髓損傷后腸道菌群會(huì)發(fā)生紊亂，嚴(yán)重降低脊髓損傷后的運(yùn)動(dòng)功能。小樣本臨床報(bào)道脊髓損傷患者腸道菌群變化特征，并發(fā)現(xiàn)5個(gè)菌屬具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義[13]。國(guó)內(nèi)張潔等[14]發(fā)現(xiàn)，急性創(chuàng)傷性脊髓損傷患者存在腸道菌群紊亂，且菌群變化與血清生化標(biāo)志物的升高相關(guān)。脊髓損傷后腸道菌群紊亂可能與病情的發(fā)展以及后期的康復(fù)結(jié)局關(guān)系密切，值得深入研究。

本研究分析脊髓損傷患者腸道菌群屬水平的變化特征，探討其在臨床康復(fù)中的意義。

1 資料與方法

1.1 一般資料

2018年1月至12月，選取本院脊髓損傷住院患者23例(患者組)，同期體檢健康受試者21例(對(duì)照組)。

診斷標(biāo)準(zhǔn)：美國(guó)脊髓損傷協(xié)會(huì)(American SpinalⅠnjury Association,ASⅠA)制定的脊髓損傷神經(jīng)學(xué)分類國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)(2013修訂)[15-16]。

納入標(biāo)準(zhǔn)：①18～60歲；②近1個(gè)月內(nèi)未使用抗生素、益生菌、益生元、合生元等制劑；③無(wú)心、肝、腎和造血系統(tǒng)等嚴(yán)重原發(fā)性疾??；④無(wú)嚴(yán)重腹瀉、炎癥性腸病等胃腸道疾病以及半年內(nèi)未進(jìn)行糞菌移植治療；⑤無(wú)呼吸衰竭、心力衰竭、腎衰、肝衰、嚴(yán)重的肺感染，膀胱感染以及癌癥等對(duì)患者生活質(zhì)量有嚴(yán)重影響的疾??；⑥受試者本人或直系親屬知曉，并簽署知情同意書(shū)。

排除標(biāo)準(zhǔn)：①妊娠期、哺乳期婦女；②不能夠配合完成本研究。

脊髓損傷患者的一般資料見(jiàn)表1。納入研究的脊髓損傷患者血液白細(xì)胞數(shù)都在正常參考范圍內(nèi)；絕大多數(shù)患者尿液中的白細(xì)胞數(shù)、細(xì)菌數(shù)都在正常范圍內(nèi)，無(wú)嚴(yán)重的膀胱感染現(xiàn)象發(fā)生，研究階段均未使用抗生素治療。

對(duì)照組中男性16例，女性5例，平均年齡(37.05±7.871)歲；患者組中男性18例，女性5例，平均年齡(35.87±8.275)歲，神經(jīng)源性腸道功能障礙(neurogenic bowel dysfunction,NBD)評(píng)分(12.57±6.298)分。兩組在性別、年齡方面無(wú)顯著性差異(P＞0.05)。見(jiàn)表2。

本研究得到中國(guó)人民解放軍西部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(No.2018ky08)，并在中國(guó)臨床試驗(yàn)中心注冊(cè)(No.ChiCTR1800016823)。

1.2 方法

準(zhǔn)備好一次性糞便容器，消毒洗手，戴一次性醫(yī)用塑料手套，每個(gè)糞便收集管收集0.5～1 g樣品，分裝后立即蓋上管蓋，盡可能使樣品處于相對(duì)厭氧環(huán)境。注意樣品不能反復(fù)凍融。

腸道菌群檢測(cè)及生物信息學(xué)分析測(cè)序步驟如下。①樣品編號(hào)后立即轉(zhuǎn)入-80 ℃的冰箱中保存。

②根據(jù)PowerFecal?DNA Ⅰsolation Kit試劑盒(德國(guó)QⅠAGEN公司)說(shuō)明書(shū)進(jìn)行糞便樣品總DNA提取。

③引物合成：合成帶有Barcode的特異引物16S。引物使用515F(5'-GTG CCA GCM GCC GCG GTA A-3') 和 806R(5'-GGA CTA CHV GGG TWT CTA AT-3')[17-18]。

④對(duì)樣本的16S rDNA V4區(qū)域進(jìn)行擴(kuò)增：以稀釋后的基因組DNA為模板，根據(jù)測(cè)序區(qū)域的選擇，使用帶Barcode的特異引物進(jìn)行聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction,PCR)。每一個(gè)25 μl的體系包括1×PCR buffer、1.5 mmol/L MgCl2、0.4 μmol/L dNTPs、正向和反向引物各1.0 μmol/L、0.5 U KOD-Plus-Neo酶(TOYOBO)和10 ng模板。PCR程序包括起始94 ℃1 min，然后30循環(huán)(變性94 ℃20 s，退火54 ℃30 s和延伸72 ℃30 s)，最后72 ℃5 min。每個(gè)樣本進(jìn)行3個(gè)重復(fù)，每個(gè)PCR反應(yīng)終止于線性擴(kuò)增期，PCR結(jié)束后將同一樣本的PCR產(chǎn)物混合后進(jìn)行電泳檢測(cè)，使用膠回收試劑盒切膠回收PCR產(chǎn)物，TE緩沖液洗脫回收目標(biāo)DNA片段。

⑤HiSeq文庫(kù)構(gòu)建及測(cè)序：使用PowerFecal?DNA提取試劑盒對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物(每個(gè)樣本3 μg)進(jìn)行測(cè)序前準(zhǔn)備，具體操作參照試劑盒說(shuō)明。使用TruSeq DNA PCR-Free Sample Prep Kit試劑盒建庫(kù)，然后在Ⅰllumina Hiseq測(cè)序儀平臺(tái)對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行雙端測(cè)序。

⑥生物信息學(xué)分析：首先對(duì)兩組屬水平上的組成進(jìn)行分析，然后通過(guò)隨機(jī)森林機(jī)器學(xué)習(xí)的方法對(duì)兩組糞便樣品中的腸道菌群進(jìn)行比較分析。

表1 脊髓損傷患者情況

表2 兩組一般資料比較

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行分析。計(jì)量資料先做正態(tài)性檢驗(yàn)及方差齊性檢驗(yàn)，若符合正態(tài)分布且滿足方差齊性，以()表示，運(yùn)用t檢驗(yàn)；若不符合上述條件，則以M(Ql,Qu)表示，運(yùn)用非參數(shù)檢驗(yàn)(Mann-WhitneyU)。顯著性水平α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 物種組成分析

由于屬水平的物種數(shù)量較多，本部分只展示相對(duì)豐度較高的菌屬。

對(duì)照組占主要地位的菌屬除了Alistipes (理研菌屬)、Parabacteroides (紫單胞菌屬)、Megasphaera (氨基酸球菌屬)、Prevotella 9 (普雷沃氏菌屬9)、Escherichia-Shigella (埃希氏菌屬-志賀氏菌屬)、Lachnospiraceae UCG-008 (毛螺旋菌屬UCG-008)、Ruminococcaceae UCG-014(瘤胃菌科UCG-014)、[Ruminococcus]torques group (瘤胃球菌屬-torques group)、Enterobacter(腸桿菌屬)、Roseburia(羅斯氏菌屬)、Lachnospiraceae UCG-004 (毛螺旋菌屬UCG-004)、Prevotella 2(普雷沃氏菌屬2)、Fusobacterium (梭桿菌屬)的平均相對(duì)豐度低于1%以外，Bacteroides (擬桿菌屬)、Megamonas (氨基酸球菌屬)、[Eubacterium]coprostan oligenes group、Ruminococcaceae UCG-002(瘤胃菌科UCG-002)、Lachnospiraceae NC2004 group (毛螺旋菌屬NC2004 group)、Lachnospiraceae NK4A136 group (毛螺旋菌屬NK4A136 group)、[Eubacterium]eligens group(優(yōu)桿菌科)、Phascolarctobacterium (光岡菌屬)等8個(gè)菌屬的平均相對(duì)豐度都大于1%。

患者組除Megamonas(氨基酸球菌屬)、Prevotella 9 (普雷沃氏菌屬9)、[Eubacterium]eligens group(優(yōu)桿菌科)、Ruminococcaceae UCG-014(瘤胃菌科UCG-014)、Enterobacter (腸桿菌屬)、Roseburia (羅斯氏菌屬)、Lachnospiraceae UCG-004 (毛螺旋菌屬UCG-004)、Prevotella 2(普雷沃氏菌屬2)、Fusobacterium(梭桿菌屬)等菌屬的平均相對(duì)豐度低于1%外，其余菌屬的相對(duì)豐度均高于1%。見(jiàn)表3。

與對(duì)照組相比，患者組Escherichia-Shigella(埃希氏菌屬-志賀氏菌屬)、Lachnospiraceae UCG-008(毛螺旋菌屬UCG-008)、Alistipes(理研菌屬)、Parabacteroides(紫單胞菌屬)、[Ruminococcus]torques group(瘤胃球菌屬-torques group)等菌屬相對(duì)豐度增高(P＜0.05)，而Fusobacterium (梭桿菌屬)的平均相對(duì)豐度降低(P＜0.05)。見(jiàn)表3。兩組間的某一些菌科差異比較明顯，并且在每個(gè)樣品中個(gè)體差異也比較明顯。

2.2 物種差異分析

本研究分析Gini指數(shù)＞0.2的菌群，發(fā)現(xiàn)兩組在各個(gè)分類水平都存在顯著性差異(P＜0.05)。在屬水平，與對(duì)照組比較，患者組中豐度升高的重要標(biāo)志性菌屬分別是：瘤胃菌科的UBA1819、Ruminiclostridium 9、Ruminococcaceae NK4A214 group、Ruminococcus 2、Ruminococcaceae UCG-005、Ruminiclostridium 5、Flavonifractor；理研菌科的Alistipes、dgA-11 gut group、Rikenellaceae RC9 gut group；毛螺菌科[Eubacterium]oxidoreducens group；消化鏈球菌科的Ⅰntestinibacter；腸桿菌科Escherichia-Shigella (志賀菌屬)；以及Tannerellaceae的Parabacteroides (P＜0.05)。患者組豐度顯著降低的是梭桿菌科的Fusobacterium菌屬(P＜0.05)。見(jiàn)圖1和表4。

3 討論

脊髓損傷后由于自主神經(jīng)功能受到損害，導(dǎo)致患者對(duì)感染的易感性增加，免疫功能降低，心血管功能障礙甚至出現(xiàn)其他代謝性疾??；抑郁、焦慮等心理問(wèn)題也隨之出現(xiàn)。此外，脊髓損傷患者由于CNS受損，經(jīng)常出現(xiàn)NBD，表現(xiàn)出便秘或大便失禁等癥狀。本組患者NBD評(píng)分結(jié)果顯示不同程度的NBD。

本研究顯示，屬于Ruminococcaceae (瘤胃菌科)的UBA1819、Ruminiclostridium 9、Ruminococcaceae NK4A214 group、Ruminococcus 2、Ruminococcaceae UCG-005、Ruminiclostridium 5、Flavonifractor豐度為增加。推測(cè)可能與脊髓損傷患者長(zhǎng)期處于抑郁狀態(tài)相關(guān)。有研究發(fā)現(xiàn)[19]，脊髓損傷患者抑郁的發(fā)生率較高。近年來(lái)，諸多研究證實(shí)腸道菌群與抑郁癥的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，其中瘤胃菌科與抑郁存在緊密聯(lián)系[20-21]。也有研究表明[22]，瘤胃球菌與CNS疾病關(guān)系密切，瘤胃球菌與神經(jīng)健康的標(biāo)志物N-乙酰天門冬氨酸(N-acetylaspartate,NAA)、血清5-羥色胺和皮質(zhì)醇呈負(fù)相關(guān)，腸道瘤胃球菌可通過(guò)血液中的皮質(zhì)醇間接影響大腦NAA。

表3 兩組在主要屬水平上的菌群相對(duì)豐度(%)

圖1 兩組屬水平上的菌群差異分析

表4 兩組屬水平上的菌群差異統(tǒng)計(jì)表

同時(shí)，我們發(fā)現(xiàn)Rikenellaceae (理研菌科)的Alistipes、dgA-11 gut group、Rikenellaceae RC9 gut group等菌屬是脊髓損傷組重要的標(biāo)志性細(xì)菌，其中Alistipes重要性最大。Zhao等[23]的研究發(fā)現(xiàn)，Alistipes菌屬相對(duì)豐度上升與結(jié)腸內(nèi)長(zhǎng)鏈飽和脂肪酸(saturated long-chain fatty acid,SLCFAs)含量增加呈正相關(guān)，SLCFAs對(duì)結(jié)腸運(yùn)動(dòng)具有刺激作用，SLCFAs增加可直接引起結(jié)腸運(yùn)動(dòng)增強(qiáng)，從而提高排便的頻率，導(dǎo)致正常宿主腸功能紊亂癥狀的發(fā)生。雖然Alistipes菌屬促進(jìn)結(jié)腸運(yùn)動(dòng)的具體機(jī)制尚不明確，是否需要完整的中樞神經(jīng)參與也不太清楚，但進(jìn)一步研究該菌屬對(duì)結(jié)腸的作用或許對(duì)促進(jìn)脊髓損傷后的胃腸蠕動(dòng)有重要的意義。

我們還發(fā)現(xiàn)患者組中某些腸道致病菌相對(duì)豐度增加，如屬于Peptostreptococcaceae (消化鏈球菌科)的Ⅰntestinibacter (腸桿菌)相對(duì)豐度增加，該病原菌可引起人體組織和器官感染，如肺部、胸膜感染，顱內(nèi)感染及軟組織感染等。屬于Enterobacteriaceae (腸桿菌科)的Escherichia-Shigella (志賀菌屬)相對(duì)豐度增多。志賀菌屬是腸道中的一類致病菌，可以引起急性直腸、結(jié)腸炎，臨床癥狀表現(xiàn)為水樣瀉、黏液膿血便、里急后重，部分患者有劇烈頭痛[24]。在脊髓損傷患者臨床康復(fù)期間的腸道管理中，我們應(yīng)該密切關(guān)注志賀菌屬與消化鏈球菌屬，積極預(yù)防各種感染以及痢疾、腹瀉等腸道疾病。

此外，本研究還發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組比較，患者組產(chǎn)生丁酸代謝產(chǎn)物的梭桿菌屬(Fusobacterium)顯著減少。丁酸對(duì)人體健康有著積極的促進(jìn)作用，具有抗炎、抗癌、增強(qiáng)結(jié)腸的防御功能、促進(jìn)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)吸收等作用[25-29]。今后還要進(jìn)一步研究其對(duì)丁酸含量的影響。

本研究初步分析了中國(guó)脊髓損傷患者腸道菌群屬水平的特征。不足之處在于樣本量較小。未來(lái)將根據(jù)不同病程、損傷程度、損傷平面對(duì)脊髓損傷患者進(jìn)行亞分組分析，以更全面、充分地闡釋脊髓損傷患者腸道菌群的變化特點(diǎn)。雖然本次研究發(fā)現(xiàn)某些與脊髓損傷患者臨床康復(fù)關(guān)系密切的腸道菌屬，但還需要通過(guò)基礎(chǔ)研究來(lái)進(jìn)一步尋求證據(jù)。密切關(guān)注脊髓損傷后的腸道菌群變化，對(duì)提高脊髓損傷患者免疫功能、生活質(zhì)量，減少并發(fā)癥，促進(jìn)全面康復(fù)，或許有一定的臨床價(jià)值。