李良建, 胡 睿, 裴 薇, 王萬軍

(西南交通大學 生命科學與工程學院， 成都 610031)

開花是判斷植株成熟的一個重要指標，適時開花能保證花朵在適宜的條件下授粉和正常結(jié)果，以保證質(zhì)量和產(chǎn)量[1]。目前發(fā)現(xiàn)植物成花調(diào)控存在6條途徑：光周期途徑(Photoperiod pathway)[2]、春化途徑(Vernalization pathway)、赤霉素途徑(GA pathway)[3]、自主途徑(Autonomous pathway)[4]、年齡途徑(Age pathway)[5]和溫度途徑[6]。這些調(diào)控途徑相互獨立又相互配合，形成有序而復雜的成花調(diào)控網(wǎng)絡，共同控制植物的生殖發(fā)育。

自主途徑是植物根據(jù)自身發(fā)育狀態(tài)而控制開花，植物在其營養(yǎng)生長達到一定階段后會自然開花，現(xiàn)在比較清楚的自主途徑是通過抑制FLC基因的表達來促進開花[7-8]。參與自主途徑的調(diào)控因子主要有FCA、FPA、FLOWERINGLOCUSY(FY)、LUMINIDEPENDENS(LD)、FLOWERINGLOCUSD(FLD)、FVE、FLK和REF6[9]。FCA是自主途徑重要調(diào)控因子。其選擇性剪接和選擇性加尾，導致FCA基因產(chǎn)生4種不同轉(zhuǎn)錄物：α、β、γ及δ，其中只有FCA-γ編碼完整有功能的FCA蛋白，含有2個RNA識別結(jié)合域(RNA-recognition motif, RRM)和1個WW蛋白相互作用結(jié)構(gòu)域[10-11]。研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)CA-γ在擬南芥(Arabidopsisthaliana)所有組織中都有表達，但在莖尖中的表達水平最高[12]；過量表達分析表明，只有過量表達FCA-γ轉(zhuǎn)錄本時，可以明顯促進植物提前開花[11]。FY是FCA WW結(jié)構(gòu)域的伴侶蛋白，F(xiàn)CA-WW結(jié)構(gòu)域與FYPPLPP基序相互作用而阻止FLCmRNA的積累，進而促進開花；此外，還能促使FCA前體mRNA在第3個內(nèi)含子處發(fā)生多聚腺苷化反應，形成較短無活性的FCA蛋白，從而實現(xiàn)FCA的自我負調(diào)控[13-14]。近年還在擬南芥中發(fā)現(xiàn)一個新的RNA結(jié)合蛋白HLP1，能特異結(jié)合到FCA轉(zhuǎn)錄本的兩個Poly (A) 位點附近，并促進遠端Poly (A) 位點的聚腺苷酸化，從而產(chǎn)生有生物學功能的全長FCA轉(zhuǎn)錄本來抑制FLC的表達，促進開花[15]。

鐵皮石斛是蘭科，石斛屬植物，具有較高的觀賞價值和藥用價值[16]。通常情況下，從種子萌發(fā)到開花至少需要3～13年，并且還具有明確的季節(jié)特性[17]。同時，春石斛的花芽分化需要低溫誘導，無低溫誘導，不能完成花芽分化[18]。目前在鐵皮石斛的研究中還沒有開花相關(guān)基因FCA的報道。本研究首次從鐵皮石斛中克隆得到開花相關(guān)基因FCA，并利用RT-qPCR技術(shù)，檢測該基因在鐵皮石斛不同組織內(nèi)的表達水平，探索其時空表達模式；同時研究低溫對鐵皮石斛FCA基因表達的影響，為探尋DoFCA調(diào)節(jié)開花的機制奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

鐵皮石斛種子接種于1/2MS培養(yǎng)基，于25 ℃恒溫培養(yǎng)室培養(yǎng)獲得試管苗，選擇成熟一致且發(fā)育良好的鐵皮石斛植株，分別收集根、莖、葉、花，提取其RNA，于-80℃保存。

選取相同條件下，具4片完全伸展葉片的植株進行脅迫處理。低溫處理：將備用植株放入4 ℃的培養(yǎng)箱中，其他的培養(yǎng)條件均保持一致，分別選取處理1、6、12、24、48和72 h的植株提取RNA，于-80 ℃保存。

1.2 方法

1.2.1 鐵皮石斛總RNA的提取及第一鏈cDNA的合成

使用Plant RNA Kit試劑盒(Omega)分別提取備用植株的根、莖、葉、花以及低溫處理的整苗植株總RNA。使用SYNERGY H1全功能酶標儀檢測總RNA含量，選擇A260/A280為1.8～2.0，且凝膠電泳檢測結(jié)果清晰的總RNA進行逆轉(zhuǎn)錄。逆轉(zhuǎn)錄反應采用TaKaRa公司的Reverse Transcriptase M-MLV (RNase H-)合成cDNA第一鏈。

1.2.2 鐵皮石斛FCA基因cDNA序列的獲取

對鐵皮石斛原球莖轉(zhuǎn)錄組二代測序數(shù)據(jù)進行分析，獲得5個FCA基因片段；以這5個片段為探針，用Blastn在鐵皮石斛轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫中進行延伸；用DNAMAN拼接后獲得鐵皮石斛FCA基因cDNA序列。根據(jù)拼接所得cDNA序列，用Primer Primer 5.0設計該基因的巢式PCR上游引物，下游引物采用3RP和3RNP(表1)，進行該基因3′ RACE，驗證DoFCA是否完整。

選25 μL體系，使用EasyTaqDNA聚合酶 (TRANSGEN BIOTECH) 進行巢氏PCR，包括：cDNA模板1 μL、上下游引物(10 μmol/L)各1 μL、EasyTaqbuffer 2.5 μL、EasyTaqDNA聚合酶 0.15 μL、ddH2O 19.35 μL；擴增條件如下：94 ℃預變性4 min；94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸3 min，共35個循環(huán)；72 ℃再延伸5 min，最后4 ℃終止反應。PCR產(chǎn)物進行1.0% 瓊脂糖凝膠電泳檢測，挑選目的條帶進行膠回收純化，純化產(chǎn)物連接到pGEM-T easy載體上，轉(zhuǎn)入感受態(tài)E.coliDH5α，用藍白斑篩選出陽性菌落，進行菌落PCR檢測，無誤后，由成都擎科梓熙生物技術(shù)有限公司測序。

表1 引物序列

1.2.3DoFCA的生物信息學分析

利用BioXM的ORF功能預測DoFCA基因開放閱讀框和蛋白質(zhì)翻譯；利用UniProtKB數(shù)據(jù)庫的BLAST在線分析工具進行基因鑒定；利用GSDS2.0在線軟件和NCBI的CDD數(shù)據(jù)庫分別分析DoFCA的基因結(jié)構(gòu)和蛋白結(jié)構(gòu)域；利用Protparam軟件對DoFCA蛋白序列進行理化性質(zhì)的分析[19]；用SOPMA軟件對DoFCA蛋白進行二級結(jié)構(gòu)預測；在UniProtKB數(shù)據(jù)庫中選取其他物種同源蛋白，利用DNAMAN (LynnonBiosoft)對其進行多序列比對分析；再選取更多同源蛋白用MEGA7構(gòu)建系統(tǒng)進化樹[20]。

1.2.4DoFCA在不同組織以及低溫脅迫條件下的基因表達分析

用RT-qPCR檢測不同組織及低溫脅迫條件下DoFCA的mRNA表達情況。根據(jù)測序獲得的cDNA序列，用Primer Primer5.0設計定量引物(表1)，選鐵皮石斛的管家基因DoActin1為內(nèi)參基因(表1)。將各類cDNA按10 μL體系進行擴增：SYBR green 5 μL，cDNA (100 ng/μL) 0.5 μL，ddH2O 2.9 μL，上下游引物(5 μmol/L)各0.8 μL；擴增條件：95 ℃預變性30 s；95 ℃變性5 s，60 ℃退火10 s，72 ℃延伸25 s，共45個循環(huán)；72 ℃再延伸30 s，4 ℃終止反應。每個實驗樣品進行3次技術(shù)重復和3次生物學重復，并設立陰性對照實驗。數(shù)據(jù)用LightCycler? 96 SW 1.1進行技術(shù)重復誤差分析，所有技術(shù)重復誤差均≤0.25，采用2-ΔΔCt方法進行相對表達量分析。

1.2.5 DoFCA-WW/FY-PPLPP的同源建模及優(yōu)化

以DoFCA-WW結(jié)構(gòu)域序列通過BLAST工具檢索蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫RCSB PDB，選用1YWI和1ZR7作為模板，序列一致性分別為64%和62%。使用Discovery Studio(DS) 3.0進行DoFCA-WW結(jié)構(gòu)域和FY-PPLPP相互作用復合物的同源建模，獲得WW/PPLPP復合物模型。

初始模型利用DS 3.0的Side-Chain優(yōu)化、Loop優(yōu)化，最后用分子動力學模擬對復合物進行整體優(yōu)化，選擇能量最低構(gòu)象進行評價和分析。

分子動力學模擬步驟：1)Minimization Ⅰ。將模型溶解于生理鹽水環(huán)境，采用最陡下降法進行10 000步能量最小化，收斂標準0.1 kJ/mol。2)Minimization Ⅱ。采用共軛梯度法進行10 000步能量最小化，收斂標準0.05 kJ/mol。3)Heating。系統(tǒng)從50 K進行40 ps加熱到300 K。4)Equilibration。在300 K系統(tǒng)進行60 ps的平衡。5)Production。在1 atm，300 K條件下以NPT系統(tǒng)進行300 ps模擬。

2 結(jié)果與分析

2.1 DoFCA基因序列的獲得以及序列分析

電子克隆后得到2689 bp cDNA序列，3′RACE克隆結(jié)果與其匹配，且包含18個A的poly(A)尾。將完整的cDNA比對到鐵皮石斛基因組數(shù)據(jù)[16]，結(jié)果顯示與XM_020833856.1的一致性達到99.9%，且具有5端和3端UTR，說明拼接結(jié)果正確且完整。利用BioXM軟件對該序列分析，發(fā)現(xiàn)開放閱讀框長度為2301 bp，編碼766個氨基酸殘基。基因結(jié)構(gòu)分析顯示基因共有19個外顯子，18個內(nèi)含子；蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域分析表明DoFCA蛋白在N-端(131～210、220～298)包含兩個RRM結(jié)構(gòu)域，C-端(605～634)存在一個WW結(jié)構(gòu)域。進一步分析發(fā)現(xiàn)兩個RRM結(jié)構(gòu)域跨越了2-13外顯子，14和15外顯子則編碼了WW結(jié)構(gòu)域。

圖1 DoFCA基因結(jié)構(gòu)

從鐵皮石斛基因組[16]中提取該基因TSS上游2000 bp啟動子區(qū)，用PlantCARE進行調(diào)控元件分析。發(fā)現(xiàn)DoFCA啟動子區(qū)存在WRKY、MYB和MYC 3種轉(zhuǎn)錄因子識別位點；熱誘導順式作用元件：STRE和AT-rich元件；激素應答元件：as-1和TGACG-motif；多種光響應元件。說明該基因可能對溫度和激素有響應。此外，還包含CCGTCC-box、GCN4基序、‘CTCC’ 順式作用元件3種元件，有研究證明這3個元件分別與植株的分生組織特異激活、胚乳表達、花藥特異基因的表達調(diào)控密切相關(guān)[21-22]。反映該基因可能在鐵皮石斛生殖發(fā)育中的重要地位。

2.2 DoFCA蛋白生物信息學分析

利用ExPASy Protparam在線軟件對DoFCA所編碼的蛋白質(zhì)進行分析，該蛋白的分子量為82 920.34 ku，理論pI為8.40，原子總數(shù)為11 463，分子式為C3600H5628N1080O1130S25；不穩(wěn)定系數(shù)Instability index為56.26，表明該蛋白質(zhì)狀態(tài)不穩(wěn)定。帶負電的殘基總數(shù)(Asp + Glu)是54個，帶正電的殘基總數(shù)(Arg + Lys)為57個。親水性平均值(GRAVY)為-0.602，為親水性蛋白。

用SOPMA對DoFCA蛋白進行二級結(jié)構(gòu)分析(圖2)，結(jié)果顯示α螺旋(藍色)占25.20%，延伸鏈(紅色)占11.23%，β轉(zhuǎn)角(綠色)占6.14%，無規(guī)則卷曲(紫色)占57.44%。無規(guī)則卷曲比重較大，說明該蛋白受側(cè)鏈相互作用的影響較大。

圖2 DoFCA二級結(jié)構(gòu)預測

Figure 2 Prediction of secondary structure of DoFCA

A0A2I0WFS5_9ASPA細莖石斛；A0A2I0ALZ0_9ASPA深圳擬蘭; A0A2I0WRQ3_9ASPA細莖石斛; A0A2H3XUN6_PHODC海棗; A0A1U8AJT4_NELNU 蓮

圖3 不同物種FCA蛋白序列的多重比對

Figure 3 Multiple alignment of FCA protein sequences from different species

選擇與DoFCA相似性較高的其他物種的蛋白序列，通過DNAMAN進行多序列比對(圖3)，一致性為68.71%(黑色表示完全一致，紅色相似性較高，綠色相似性較低)，比較發(fā)現(xiàn)保守區(qū)域主要集中在兩個RRM結(jié)構(gòu)域和WW結(jié)構(gòu)域部分，表明該蛋白在不同物種中功能保守。

2.3 DoFCA系統(tǒng)發(fā)育分析

在UniProtKB數(shù)據(jù)庫下載與DoFCA蛋白相似度較高的其他植物FCA蛋白，使用Clustalw進行多序列對齊，選擇最大似然法進行系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建(圖4)，氨基酸替換模型選擇JTT Matrix-based model。

結(jié)果顯示DoFCA蛋白與石斛類FCA蛋白的進化關(guān)系最近，并且單子葉植物FCA蛋白(藍色)和雙子葉植物FCA(紅色)明顯分為兩支。說明FCA蛋白在單子葉和雙子葉植物進化過程中出現(xiàn)了分化，與以往研究相符[13]。

分支上的數(shù)字表示1000次重復搜索的自展百分比，標尺代表遺傳距離

圖4 不同物種的FCA蛋白序列系統(tǒng)發(fā)育樹

Figure 4 Phylogenetic tree analysis of FCA protein sequences from different species

A：Ramachandran圖；B：PROSA分析

圖5 DoFCA-WW同源建模優(yōu)化后評價結(jié)果
Figure 5 Evaluation results of DoFCA-WW homologous modeling optimization

2.4 DoFCA-WW/FY-PPLPP復合物結(jié)構(gòu)及相互作用分析

同源建模和優(yōu)化后，利用Ramachandran圖(圖5-A)檢測模型立體化學的準確性，96.3%集中在最優(yōu)區(qū)域和合理區(qū)域，僅3.7%分布在不合理區(qū)域，立體化學檢測合格；PROSA分析(圖5-B)反映蛋白質(zhì)序列的長度和蛋白質(zhì)所在的區(qū)域是否在晶體結(jié)構(gòu)的合理區(qū)域，檢測結(jié)果合格；Verify3D檢測每個氨基酸殘基側(cè)鏈的合理性，DoFCA-WW每個殘基平均分數(shù)均大于0.2，側(cè)鏈結(jié)構(gòu)合理。

圖6-A為獲得穩(wěn)定的DoFCA-WW/FY-PPLPP復合物結(jié)構(gòu)。通過對復合物結(jié)合模式的分析(圖6-B)，發(fā)現(xiàn)DoFCA-WW結(jié)構(gòu)域中有8個相互作用結(jié)合位點：6His、10Glu、12Phe、14Tyr、16Tyr、22Glu、23Ser和25Trp。其中14Tyr、16Tyr、23Ser及25Trp 4個位點與FY-PPLPP相互作用最緊密，并且DoFCA-WW結(jié)構(gòu)域的23Ser和FY-PPLPP基序的第2個Pro殘基形成氫鍵。丙氨酸掃描8個結(jié)合位點也發(fā)現(xiàn)14Tyr、16Tyr、23Ser及25Trp的突變均會使復合物相互作用降低，說明這4個位置可能為關(guān)鍵結(jié)合位點。結(jié)合位點的飽和突變發(fā)現(xiàn)：6His變?yōu)門yr、12Phe變?yōu)門rp、23Ser變?yōu)門hr或Val均能提高復合物穩(wěn)定性；而25Trp的突變均會使復合物模型不穩(wěn)定，反映了該殘基的重要；同時14Tyr突變?yōu)楸奖彼嵬獾陌被嵋矔箯秃衔锊环€(wěn)定，可能為潛在關(guān)鍵位點。

A：DoFCA-WW/FY-PPLPP復合物結(jié)構(gòu)，F(xiàn)Y-PPLPP配體(藍色箭頭)，DoFCA-WW受體(橘色箭頭)；B：相互作用模式

圖6 DoFCA-WW/FY-PPLPP復合物結(jié)構(gòu)及相互作用模式

Figure 6 DoFCA-WW/FY-PPLPP complex structure and interaction pattern

2.5 DoFCA基因在不同組織以及低溫脅迫條件下的基因表達分析

以DoActin1基因(表1)作為內(nèi)參，進行RT-qPCR的分析，用2-ΔΔCt方法對原始Ct 值進行計算后得到DoFCA的相對表達量(不同組織以根的表達作為基準，低溫脅迫以正常情況表達為基準)，結(jié)果如圖7所示。

A：不同組織DoFCA表達水平；B：低溫條件下DoFCA表達水平

圖7DoFCA在不同組織以及低溫脅迫下的表達分析

Figure 7 Analysis ofDoFCAgene expression in different tissues and low temperature stress

DoFCA基因在不同組織中的表達結(jié)果顯示，DoFCA在鐵皮石斛花中表達量最高，而在根中的表達量最少，莖和葉中差別不大；表明DoFCA基因主要在花的形成和發(fā)育過程中發(fā)揮作用(圖7-A)。低溫脅迫的表達結(jié)果顯示，初期DoFCA表達量逐漸減少，在處理到12 h時，表達量降到最低，之后表達量逐漸升高，高于正常值(圖7-B)。

3 討論與結(jié)論

目前鐵皮石斛自主開花途徑研究較少，F(xiàn)CA基因是自主開花途徑中促進植物開花的保守基因，對其開展研究有助于更好地了解其調(diào)控機制。本研究獲得了鐵皮石斛FCA基因的完整開放閱讀框，長度為2301 bp，編碼766個氨基酸殘基?；蚪Y(jié)構(gòu)分析顯示其有19個外顯子，18個內(nèi)含子，這可能與該基因復雜的可變剪接有關(guān)。DoFCA蛋白的多序列比對顯示，該蛋白在多個物種存在保守區(qū)域，保守區(qū)域主要集中在RRM結(jié)構(gòu)域和WW結(jié)構(gòu)域，說明該蛋白在多個物種中功能保守。系統(tǒng)發(fā)育分析指出在單子葉和雙子葉植物中，F(xiàn)CA蛋白明顯分為兩支，說明FCA蛋白在單子葉和雙子葉植物進化過程中出現(xiàn)了分化，與以往研究相符[13]；同時，在單子葉植物FCA中，含有一個特異Glycine-Rich的結(jié)構(gòu)域，在信號途徑中調(diào)控G蛋白的功能，這可能是單子葉植物FCA功能多樣性的原因之一[13]。

本研究發(fā)現(xiàn)DoFCA在鐵皮石斛的表達存在組織特異性，在花中特異富集，其他組織中表達量較少。FCA基因在擬南芥幾乎所有組織中表達，但在莖尖中的表達水平最高[12]。菜心BrcuFCA的強表達主要集中在花上[23]。對擬南芥FCA晚花突變體的研究也發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)CA參與了植物營養(yǎng)生長時相轉(zhuǎn)變的調(diào)控[24]。說明DoFCA對于花的發(fā)生和形成可能具有重要作用。

在溫度對石斛蘭花芽分化的研究中發(fā)現(xiàn)持續(xù)足夠時間的低溫是花芽分化的關(guān)鍵，低溫誘導，能夠促進花芽分化[25]。擬南芥開花研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)CA可通過依賴FLC的春化途徑或者不依賴FLC響應環(huán)境溫度變化從而調(diào)控成花[14,26]。本研究發(fā)現(xiàn)DoFCA對低溫脅迫有響應，且低溫處理一段時間能促進DoFCA的積累。AI的研究也表明環(huán)境溫度的變化可能改變PtFCA的表達模式[27]。說明DoFCA可能在低溫誘導石斛蘭花芽分化過程中發(fā)揮作用。

目前發(fā)現(xiàn)FCA至少有兩個功能，即促進開花和負面調(diào)節(jié)自己的表達，這兩個功能都需要完整的FCA-WW結(jié)構(gòu)域與FY相互作用實現(xiàn)，并且WW結(jié)構(gòu)域中的第二個色氨酸的突變會使其功能缺失[14]。對DoFCA-WW/FY-PPLPP相互作用模型進行分析，發(fā)現(xiàn)14Tyr、16Tyr、23Ser及25Trp 4個位點與FY-PPLPP相互作用最緊密。飽和突變發(fā)現(xiàn)25Trp的突變均會使復合物模型不穩(wěn)定，反應了該殘基的重要；同時14Tyr突變?yōu)楸奖彼嵬獾陌被嵋矔箯秃衔锊环€(wěn)定，可能為潛在關(guān)鍵位點，可進一步試驗證明。

FCA除了與開花時間調(diào)控有關(guān)，目前還被證實與其他發(fā)育過程相關(guān)，比如種子休眠，種子千粒重和纖維產(chǎn)量等[28]。在擬南芥中FCA通過響應環(huán)境溫度能促進miR172前體(pri-miR172)，促進miR172積累，從而促進早花[12]。DoFCA啟動子中也發(fā)現(xiàn)CCGTCC-box、GCN4基序、‘CTCC’ 順式作用元件，被證實分別與植株的分生組織特異激活、胚乳表達、花藥特異基因的表達調(diào)控密切相關(guān)[21-22]。反映FCA基因具有更多作用，有待進一步發(fā)掘。

本研究對鐵皮石斛DoFCA基因進行了克隆，通過生物信息學分析和表達模式研究，發(fā)現(xiàn)該基因?qū)﹁F皮石斛花的發(fā)生有重要的調(diào)控作用，為該基因在石斛中的功能研究奠定了基礎，也為深入研究DoFCA提供了依據(jù)。