劉晨晨，駱海燕，鄶艷榮，高小博，陸彩玲*

(1.國家衛(wèi)生健康委科學技術(shù)研究所遺傳優(yōu)生中心，北京 100081；2. 北京協(xié)和醫(yī)學院研究生院，北京 100005)

卵巢的主要功能是分泌甾體激素和排卵，其中甾體激素主要是雌激素和孕激素[1]。顆粒細胞是哺乳動物卵泡內(nèi)最大的細胞群[2]，也是雌激素和孕激素合成的主要場所[3]。雌激素可以促進卵泡的生長和排卵，刺激子宮內(nèi)膜增生和血管形成以及維持月經(jīng)周期等[4]。雌二醇(17β-estradiol，E2)是女性生殖系統(tǒng)中活性最強的雌激素[5]。孕酮(Progesterone，P4)是孕激素的主要活性形式，它維持著卵巢月經(jīng)周期和妊娠的正常功能，同時也是其它許多甾體激素合成的中間體[6]。甾體激素合成急性調(diào)節(jié)蛋白(steroidogenic acute regulatory protein，StAR)參與將甾體激素的前體膽固醇由線粒體外膜向線粒體內(nèi)膜的轉(zhuǎn)運，這是孕酮合成的限速步驟。膽固醇在膽固醇側(cè)鏈裂解酶(cytochrome P450scc enzyme，P450scc)的作用下可轉(zhuǎn)化為孕烯醇酮，后者在一系列酶的作用下生成雄激素，而雄激素在芳香化酶(aromatase)的作用下又可生成雌二醇[7-9]。Sirtuin1(Sirt1)是一種組蛋白去乙?；?，有研究發(fā)現(xiàn)，Sirt1可以促進顆粒細胞中孕酮和雌二醇的合成及其關(guān)鍵酶StAR和芳香化酶的表達[10-11]。

甾體激素合成酶類受體內(nèi)外多種因素的調(diào)節(jié)，其中外源因素包括環(huán)境內(nèi)分泌干擾物。環(huán)境內(nèi)分泌干擾物包括天然和人工合成的化合物，其中很多都有擬雌激素活性[12]。擬除蟲菊酯類農(nóng)藥是一種人工合成農(nóng)藥，具有高效、低毒和廣譜等特性，因此成為毒性較強的有機磷和有機氯農(nóng)藥的理想替代品。研究表明，擬除蟲菊酯類農(nóng)藥具有擬雌激素活性，是一種環(huán)境內(nèi)分泌干擾物[13]。一些擬除蟲菊酯類農(nóng)藥如氰戊菊酯和聯(lián)苯菊酯會干擾卵巢內(nèi)甾體激素的合成及關(guān)鍵酶的表達[14-15]。溴氰菊酯(Deltamethrin，DLT)是一種常見的擬除蟲菊酯類農(nóng)藥，被廣泛應(yīng)用于經(jīng)濟作物、倉庫等害蟲防治。Camargo-Mathias等[16]發(fā)現(xiàn)DLT可以直接作用于蜱蟲的卵巢。Ge等[17]發(fā)現(xiàn)DLT可以影響半翅目Delphacidae卵巢內(nèi)總RNA和蛋白質(zhì)的合成，抑制產(chǎn)卵。還有報道稱，在41%的南非的人母乳樣本中檢測到了DLT[18]。但目前還沒有關(guān)于DLT影響卵巢內(nèi)甾體激素合成及關(guān)鍵酶表達的相關(guān)報道，因此本研究探討了DLT對大鼠卵巢和原代顆粒細胞中甾體激素合成及其關(guān)鍵酶表達的影響。

材料和方法

一、實驗材料

1.實驗動物：出生21 d的健康雌性Sprague-Dawley(SD)大鼠，SPF級，體重55～60 g，購自北京維通利華，飼養(yǎng)于國家衛(wèi)生健康委科學技術(shù)研究所實驗動物中心。動物飼養(yǎng)條件：溫度(22±2)℃，空氣相對濕度(55±15)%，晝夜周期12/12 h，保證有充足的鼠糧和水。

2.主要試劑和設(shè)備：DMEM/F12液體培養(yǎng)基、胎牛血清(Hyclone，美國)；孕馬血清促性腺激素(PMSG，北京海德創(chuàng)業(yè)生物)；溴氰菊酯(天津必斯特化學)；17-β雌二醇、孕酮電化學發(fā)光法試劑盒(羅氏，美國)；酶標儀(Bioteck，美國；Gen5，=450 nm)；StAR和芳香化酶兔多克隆抗體(ABclonal，美國)；P450scc兔多克隆抗體(Cell Signaling，美國)；Sirt1兔多克隆抗體(Santa Cruz，美國)；辣根過氧化物酶(HRP)-山羊抗兔IgG二抗(北京中杉金橋)。

二、研究方法

1.體內(nèi)實驗：將21 d齡的雌性SD大鼠按體重區(qū)段隨機分組法進行分組，每組7只，分為空白對照組和實驗組。實驗組分別給予6.25 mg·kg-1·d-1、12.50 mg·kg-1·d-1DLT(根據(jù)大鼠灌胃的半數(shù)致死量及文獻中DLT的大鼠灌胃劑量[19-21]，我們選擇了這兩個相對較低的給藥劑量。)，對照組給予玉米油。每天灌胃一次，連續(xù)灌胃7 d。于第8天早晨進行安樂死，并對所有大鼠用戊巴比妥鈉進行麻醉后取血，保存于非促凝采血管中，收集卵巢用于后續(xù)提取蛋白。

2.原代顆粒細胞的分離及培養(yǎng)：21 d齡的雌性SD大鼠每只腹腔注射20 U的PMSG注射液，飼養(yǎng)48 h后頸椎脫臼處死并在無菌條件下迅速取出雙側(cè)卵巢，剔除卵巢被膜及周圍組織，用1 ml注射器針頭刺破卵泡使顆粒細胞釋放出來，將顆粒細胞重懸于含15% FBS的DMEM/F12培養(yǎng)基中，并以合適的密度接種于細胞培養(yǎng)皿中，置于37℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，以備后續(xù)處理。

3.顆粒細胞的處理：用二甲基亞砜將DLT溶解配成300 mmol/L的貯存液為母液，依次梯度稀釋成200 mmol/L、100 mmol/L，貯存于-20℃冰箱，分裝備用。待顆粒細胞貼壁培養(yǎng)24～48 h后，用無血清培養(yǎng)基饑餓細胞12 h后，換液，并分別用二甲基亞砜(對照組)、100 μmol/L、200 μmol/L、300 μmol/L的DLT處理細胞48 h。

4.電化學發(fā)光法測定雌二醇和孕酮：收集DLT處理后的大鼠血清和顆粒細胞上清液，儲存于-80℃，按照雌二醇和孕酮電化學發(fā)光法試劑盒說明書測定雌二醇和孕酮的水平。

5.組織及細胞蛋白提?。航M織總蛋白提取時每0.1 g組織加100 μl裂解液(RIPA、100×PMSF、100×NaF、蛋白酶抑制劑)，用超聲波細胞粉碎機超聲10～20 s；細胞總蛋白提取時需吸去細胞培養(yǎng)基，用生理鹽水潤洗細胞，收集細胞于滅菌的1.5 ml離心管中，室溫，800 rpm離心，棄去生理鹽水，加適量配好的裂解液裂解蛋白。之后冰上裂解30 min，期間每10 min旋渦震蕩15 s，4℃，13 000 rpm離心15 min，收集上清，分裝，-80℃存放。

6.Western Blot檢測方法：利用BCA蛋白定量試劑盒(Sigma，美國)進行蛋白濃度定量，12% SDS-PAGE分離蛋白，轉(zhuǎn)印至硝酸纖維素膜上。用5%的脫脂牛奶封閉1 h后，分別用一抗4℃孵育過夜，PBST漂洗，隨后用HRP標記的二抗室溫孵育1 h，PBST漂洗后，ECL化學顯影。實驗中用β-actin作為內(nèi)參照，利用Image J軟件進行灰度定量分析。

三、統(tǒng)計學分析

結(jié) 果

一、DLT對大鼠卵巢內(nèi)甾體激素合成的影響

對大鼠進行了DLT濃度為0、6.25、12.50 mg·kg-1·d-1為期7 d的暴露處理，收集血清，通過電化學發(fā)光法檢測雌二醇和孕酮水平的變化。結(jié)果顯示，與對照組相比，實驗組的雌二醇水平升高、孕酮水平下降，且差異均具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)(圖1)。

A：雌二醇；B：孕酮；與對照組比較，*P**P圖1 DLT暴露7 d后大鼠血清中甾體激素分泌水平的變化

二、DLT對大鼠卵巢內(nèi)甾體激素合成關(guān)鍵酶及Sirt1表達的影響

為了檢測DLT暴露處理大鼠，卵巢內(nèi)甾體激素合成關(guān)鍵酶及Sirt1表達量的變化，我們用Western Blot法對卵巢組織中StAR、P450scc、芳香化酶及Sirt1的表達量進行了檢測。結(jié)果顯示，與對照組相比，實驗組中StAR、P450scc、芳香化酶及Sirt1的表達量均顯著升高(P<0.01)，且StAR、P450scc和芳香化酶的表達量具有劑量依賴性(圖2)。

三、DLT對原代顆粒細胞中甾體激素合成的影響

為了進一步探究DLT對顆粒細胞中甾體激素合成的影響，我們分離了大鼠原代顆粒細胞，分別用0、100、200、300 μmol/L的DLT處理48 h后，收集上清，通過電化學發(fā)光法檢測顆粒細胞中雌二醇和孕酮分泌水平的變化。結(jié)果顯示，與對照組相比，實驗組中雌二醇水平顯著升高(P<0.001)，孕酮水平?jīng)]有顯著性變化(P>0.05)(圖3)。

A：Western Blot檢測；B：灰度分析柱狀圖；與對照組比較，*P#P圖2 DLT暴露7 d后大鼠卵巢中StAR、P450scc、芳香化酶及Sirt1的表達情況

A：雌二醇；B：孕酮；與對照組比較，*P圖3 DLT處理顆粒細胞48 h后上清液中甾體激素分泌水平的變化

四、DLT對原代顆粒細胞中甾體激素合成關(guān)鍵酶及Sirt1表達的影響

進一步檢測不同濃度DLT(0、100、200、300 μmol/L)處理下，原代顆粒細胞中甾體激素合成關(guān)鍵酶及Sirt1表達量的變化，我們用Western Blot法對顆粒細胞中StAR、P450scc、芳香化酶及Sirt1的表達量進行了檢測。結(jié)果顯示，與對照組相比，隨著DLT濃度的升高，StAR、P450scc、芳香化酶及Sirt1的表達量均顯著升高(P<0.001)，且具有劑量依賴性(圖4)。

A：Western Blot檢測；B：灰度分析柱狀圖(各處理組4柱自左至右分別示0、100、200、300 μmol/L處理后)；與對照組比較，*P圖4 DLT處理48 h后顆粒細胞中StAR、P450scc、芳香化酶及Sirt1的表達情況

討 論

DLT可以干擾雄性生殖系統(tǒng)，并誘導睪丸細胞凋亡[20，22]。但目前關(guān)于DLT對雌性生殖系統(tǒng)影響方面的研究主要以昆蟲為研究材料[16-17]，其對哺乳動物卵巢功能影響方面的研究鮮見報道。本研究發(fā)現(xiàn)了DLT可以影響大鼠卵巢內(nèi)甾體激素的分泌及其關(guān)鍵酶的表達。我們分別進行了體內(nèi)外實驗，探究在DLT暴露下，大鼠卵巢和原代顆粒細胞中孕酮和雌二醇分泌量的變化，同時檢測了影響這些甾體激素合成的關(guān)鍵酶StAR、P450scc及芳香化酶表達量的變化。體內(nèi)實驗中，我們發(fā)現(xiàn)在DLT暴露下孕酮的分泌量減少了，且有統(tǒng)計學差異(P<0.05)。同時檢測了控制孕酮合成的關(guān)鍵酶StAR和P450scc表達量的變化，發(fā)現(xiàn)隨著DLT暴露濃度的升高，StAR和P450scc表達量均逐漸增加(P<0.001)。孕酮分泌量變化與其關(guān)鍵酶表達量變化不一致，這可能是由于孕酮更快地轉(zhuǎn)化成了代謝產(chǎn)物，從而造成檢測到的孕酮水平降低。Nimrod[23]發(fā)現(xiàn)FSH促進大鼠卵巢顆粒細胞中孕酮生成的同時也激活了一系列促使孕酮代謝的脫氫酶和還原酶。Crellin[24]發(fā)現(xiàn)甲氧滴滴涕抑制豬顆粒細胞中孕酮生成的同時，促進了P450scc的表達。同時在體內(nèi)實驗中，雌二醇的分泌量升高了(P<0.05)，這可能是芳香化酶表達量增加(P<0.001)的原因。體外實驗中，我們發(fā)現(xiàn)在DLT處理下，大鼠原代顆粒細胞中孕酮水平基本不變，雌二醇分泌量有升高(P<0.001)，但數(shù)值變化不大。我們還檢測到孕酮合成的關(guān)鍵酶StAR和P450scc表達量均逐漸增加(P<0.001)，且呈劑量依賴效應(yīng)。雌二醇合成的關(guān)鍵酶芳香化酶的表達量增加了(P<0.001)。StAR和P450scc表達量增加幅度較大，而孕酮和雌二醇的變化水平較微弱，這可能是由于DLT同時促進了孕酮和雌二醇的代謝過程，造成檢測到的孕酮和雌二醇的變化水平不大。Chen等[25]發(fā)現(xiàn)三氯生促進大鼠原代顆粒細胞中雌二醇合成酶芳香化酶表達的同時，也促進了雌二醇代謝酶Cyp1a1和Cyp1b1的表達?？傊?，DLT對卵巢甾體激素合成是多因素、多層次的調(diào)節(jié)，雌二醇和孕酮的分泌水平取決于其合成和代謝速率的動態(tài)平衡。

Reverchon等[26]發(fā)現(xiàn)內(nèi)脂素可以通過Sirt1來促進牛卵巢顆粒細胞中雌二醇和孕酮的分泌，并且促進StAR的表達。本研究發(fā)現(xiàn)，在DLT處理下甾體激素關(guān)鍵酶StAR、P450scc、芳香化酶表達量增加的同時，Sirt1的表達量也增加了(P<0.01)，這提示DLT可能通過Sirt1來影響甾體激素合成關(guān)鍵酶的表達及甾體激素的合成。但這還需進一步的探索和驗證。

綜上，在DLT的暴露下，體內(nèi)外實驗中甾體激素合成關(guān)鍵酶StAR、P450scc和芳香化酶表達量均增加了，同時體內(nèi)實驗中孕酮的分泌量減少、雌二醇的分泌量增加，體外實驗中雌二醇的分泌量增加。孕酮對于腺垂體激素分泌、排卵、孕卵著床和正常妊娠的維持有重要作用，還能促進乳腺腺泡的發(fā)育和成熟，它的減少會影響生殖器官的生長發(fā)育和功能[27]。Vorherr[28]發(fā)現(xiàn)雌二醇的增加會使下丘腦-垂體-卵巢軸功能紊亂、月經(jīng)不調(diào)以及乳腺纖維囊性增生。雌二醇還與一些癌癥如乳腺癌、卵巢癌和子宮內(nèi)膜癌等的發(fā)生有關(guān)[29-31]。這提示DLT可能會通過降低孕酮分泌量和提高雌二醇分泌量來干擾雌性生殖系統(tǒng)。本研究在一定程度上為評估DLT對女性生殖功能的影響提供了依據(jù)。