程龍鳳，袁靜*，魏兆蓮，李琴，周培，張小鵬，陳薇，方慧琴，吳仁花

(1.安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科，合肥 230022；2.國家衛(wèi)生健康委配子及生殖道異常研究重點實驗室，合肥 230022；3. 出生人口健康教育部重點實驗室，合肥 230022；4.生殖健康與遺傳安徽省重點實驗室，合肥 230022；5. 安徽省生命資源保存與人工器官工程技術(shù)研究中心(安徽醫(yī)科大學(xué))，合肥 230022)

產(chǎn)前診斷是對高危妊娠胎兒進行先天缺陷和遺傳性疾病的診斷，是預(yù)防出生缺陷、提高人口素質(zhì)的主要手段。傳統(tǒng)的細(xì)胞遺傳學(xué)方法，如G顯帶染色體核型分析是染色體病產(chǎn)前診斷的一線方法[1-2]。細(xì)胞核型分辨率約為5～10 Mb，但染色體微缺失/重復(fù)綜合征難以在核型分析中被檢測出來[3]。這些染色體微缺失/重復(fù)已被確定為許多人類疾病常見病因[4]。而基于下一代測序的基因組拷貝數(shù)變異測序(CNV-seq)可檢測出全染色體組非整倍體和100 kb以上的拷貝數(shù)變異(CNV)。本研究通過染色體核型分析聯(lián)合CNV-seq對455 例不同指征的高危妊娠胎兒行產(chǎn)前診斷，同時分析不同指征與染色體異常的關(guān)系，比較兩種方法對染色體異常的檢出率，探討CNV-seq在臨床產(chǎn)前診斷中的應(yīng)用價值。

資料與方法

一、研究對象

收集2018 年1～12 月在安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院產(chǎn)前診斷中心就診并接受侵入性產(chǎn)前診斷的高危妊娠孕婦臨床資料，根據(jù)不同孕周選擇羊膜腔穿刺術(shù)或臍靜脈穿刺術(shù)，羊水或臍血樣本同時送檢染色體核型分析和CNV-seq檢測。最終入組455 例，孕婦年齡18～49 歲，孕周為18～33 周。所有孕婦在侵入性產(chǎn)前診斷前均接受產(chǎn)前診斷咨詢并充分告知其穿刺相關(guān)風(fēng)險、染色體核型分析和CNV-seq各自的檢測范圍和局限性后，簽署穿刺術(shù)及檢測知情同意書。

二、不同指征的定義及分類

根據(jù)不同的產(chǎn)前診斷指征，將高危妊娠胎兒分為以下兩類：(1)非超聲相關(guān)高危組：包括高齡(孕婦年齡≥35 周歲，包括分娩時滿35 周歲)、血清學(xué)篩查高風(fēng)險、NIPT高風(fēng)險、不良妊娠史以及其他；(2)超聲相關(guān)高危組：包括超聲軟指標(biāo)異常和明確的胎兒超聲結(jié)構(gòu)異常。

三、方法

羊水/臍血管穿刺術(shù)：孕18～23 周孕婦行羊水穿刺術(shù)，孕26～33 周孕婦行臍帶穿刺術(shù)。具體方法如下：超聲引導(dǎo)下進行羊膜腔穿刺或臍靜脈穿刺術(shù)，取羊水約25 ml，其中20 ml行染色體核型分析(320 條帶)，5 ml用于CNV-seq檢測。臍血3.5 ml，其中1.5 ml送檢染色體核型分析，2 ml用于CNV-seq。

G顯帶染色體核型分析：20 ml羊水樣本離心7 min，吸上清，留取1 ml脫落上皮細(xì)胞，加入培養(yǎng)基(廣州輝達)3.5 ml至培養(yǎng)瓶。培養(yǎng)12 d，觀察其細(xì)胞克隆情況，換液，第2或3天觀察是否收獲。胰酶消化2.5 min，1 500 rpm離心7 min，棄上清，低滲，固定后滴片。80℃烤箱烘烤2.5 h，采用G顯帶處理。1.5 ml臍血接種于淋巴細(xì)胞培養(yǎng)基(廣州輝達)中，培養(yǎng)72 h，加入秋水仙素，2.5 h后收獲，1 500 rpm離心7 min后處理同前。顯微鏡下計數(shù)，分析10個核型，嵌合體加倍計數(shù)。

CNV-seq檢測：提取羊水中脫落細(xì)胞或臍血細(xì)胞基因組DNA，將50 ng全基因組DNA使用限制性內(nèi)切酶水解，獲得平均大小為200 bp的DNA片段，采用PCR-free建庫方法進行文庫制備(杭州貝瑞基因)。在NextSeq CN500 高通量測序平臺(杭州貝瑞基因)，36 bp單端測序，測序深度0.1×。所有測定序列，通過檢索DGV、DECIPHER、OMIM、UCSC以及PubMed等數(shù)據(jù)庫進行CNV臨床意義的確定。

四、統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS20.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)處理。計量資料以均數(shù)和標(biāo)準(zhǔn)差表示，計數(shù)資料以頻數(shù)和構(gòu)成比表示。

結(jié) 果

一、G顯帶染色體核型分析與CNV-seq檢測結(jié)果

1.G顯帶染色體核型分析：在455 例產(chǎn)前診斷的孕婦中，共檢出染色體異常22例，陽性率為4.83%(22/455)。其中，非整倍體17例(其中21-三體9例，18-三體5例，性染色體非整倍體3例)，微缺失2例，微重復(fù)2例，嵌合體1例。染色體多態(tài)5例(均為9號染色體臂間倒位)。

2.CNV-seq：CNV-seq共檢出異常42例，陽性率為9.23%(42/455)。其中致病性異常31 例，可能致病性異常11例。致病性異常中非整倍體17例、微重復(fù)4例、微缺失5例、微缺失合并微重復(fù)3例、嵌合體2例；可能致病性異常中微重復(fù)4例、微缺失6例、嵌合體1例(表1，表2)。

二、非超聲相關(guān)高危組染色體核型分析及其對應(yīng)CNV-seq結(jié)果異常的情況

在非超聲異常高危妊娠胎兒中染色體核型分析檢出異常10例。CNV-seq檢測出致病性異常14例，可能致病性異常8例。

其中，NIPT高危孕婦染色體核型檢出異常8例，CNV-seq檢出致病性異常9例，可能致病性異常1例。不良妊娠史孕婦染色體核型未檢出明顯異常，CNV-seq檢出致病性異常2例，可能致病性異常2例。高齡孕婦染色體核型檢出異常2例，CNV-seq檢出致病性異常2例，可能致病性異常3例。余指標(biāo)染色體核型未檢出明顯異常，CNV-seq檢出致病性異常1例，可能致病性異常2例(表1)。

三、超聲相關(guān)高危組染色體核型分析及其對應(yīng)CNV-seq結(jié)果異常的情況

超聲相關(guān)的高危孕婦胎兒中染色體核型分析檢出12例異常，CNV-seq共檢出17例致病性異常，3例可能致病性異常(表2)。

表1 非超聲相關(guān)高危組染色體核型分析及其對應(yīng)CNV-seq結(jié)果異常

表2 超聲相關(guān)高危組染色體核型分析及其對應(yīng)CNV-seq結(jié)果異常

討 論

出生缺陷主要原因之一為染色體病和基因組病[5]，且目前尚無有效治療手段。核型分析技術(shù)對染色體數(shù)目以及結(jié)構(gòu)異常的診斷可靠準(zhǔn)確，經(jīng)濟實惠，是染色體異常產(chǎn)前診斷的金標(biāo)準(zhǔn)被廣泛應(yīng)用。但是G顯帶染色體核型分析只可檢測>5 Mb的染色體片段異常，無法辨別微小變異的缺失/重復(fù)，且對于臨床潛在風(fēng)險的認(rèn)知有限[6-7]。CNV-seq檢測通過在下一代測序平臺(NGS)對全基因組范圍內(nèi)檢測>100 kb的染色體拷貝數(shù)變異(缺失/重復(fù))，以及染色體非整倍體，并通過檢索數(shù)據(jù)庫進行分析其是否為異常。染色體的微缺失/微重復(fù)是胎兒致畸或智力低下等發(fā)育異常的重要原因之一[8-10]。本研究使用G顯帶染色體核型分析和CNV-seq檢測兩種方法，回顧性分析了455例有產(chǎn)前診斷指征的高危妊娠孕婦胎兒染色體異常情況，比較了兩種檢測方法染色體異常檢出率，并分析了不同產(chǎn)前診斷指征的染色體異常情況。

有研究表明，CNV-seq檢測對染色體檢查的準(zhǔn)確性與傳統(tǒng)的核型分析相當(dāng)且分辨率更高[11-12]。本研究中，G顯帶染色體核型分析總的異常檢出率為4.83%，CNV-seq總檢出率為9.23%，CNV-seq較傳統(tǒng)的細(xì)胞遺傳學(xué)檢測可多檢出4.4%異常。與之結(jié)果一致，說明CNV-seq可以提高染色體異常檢出率，進而為臨床上產(chǎn)前診斷及遺傳咨詢提供更多依據(jù)。

在染色體異常中，核型分析檢出非整倍體17例，CNV-seq與之檢測結(jié)果一致。核型分析檢出微缺失2例，微重復(fù)2例。經(jīng)CNV-seq驗證，此4例染色體片段異常均為致病性異常，CNV-seq相對精準(zhǔn)的定位了異常片段及其大小，對于解讀這些區(qū)域內(nèi)包含的功能基因有益。倒位5例，均為9號染色體臂間倒位，其中CNV-seq檢測4例提示結(jié)果正常，另1例檢測到11號染色體片段重復(fù)，與核型分析提示的9號染色體倒位并不一致，說明CNV-seq檢測技術(shù)具有局限性，即無法檢測出染色體倒位變異，推論亦無法檢測平衡易位這類結(jié)構(gòu)變異，也說明了核型分析即使對于相對較大的片段仍有漏診的可能性。此外，染色體核型分析檢出嵌合1例。有研究表明，CNV-seq技術(shù)可以檢測到低比例的嵌合體，在理想條件下可檢測低至5%的染色體非整倍體嵌合[13-14]，在臨床樣本中可發(fā)現(xiàn)超過10%的染色體非整倍體嵌合[15]。本研究細(xì)胞學(xué)檢測出的嵌合體核型為45，XO/46，XN經(jīng)驗證為45，X[50%]/46，XY[50%]的嵌合體。另有2例染色體核型未見明顯異常，而CNV-seq檢測出嵌合情況，并給出嵌合比例。比較而言，CNV-seq對嵌合體的診斷較傳統(tǒng)的細(xì)胞學(xué)檢測有更高的準(zhǔn)確性，可為臨床遺傳咨詢提供更多解讀依據(jù)。

本研究將高危妊娠孕婦分為非超聲異常高危組和超聲異常高危組。其中，非超聲異常包括高齡、血清學(xué)篩查高風(fēng)險、NIPT高風(fēng)險、不良妊娠史，以及其他。對于超聲異常的高危孕婦分為超聲軟指標(biāo)異常以及明確的胎兒超聲結(jié)構(gòu)異常。超聲軟指標(biāo)并不能完全提示胎兒的結(jié)構(gòu)發(fā)育異常，可能是一種正常的變異[16]。有研究表明，在超聲提示胎兒結(jié)構(gòu)異常而染色體未見明顯異常的胎兒中，有6%～7%存在致病或可疑致病性異常的CNVs[17]。本研究中超聲相關(guān)的高危孕婦中，CNV-seq共檢出17例致病性異常，其中8例為染色體非整倍體，與染色體核型分析結(jié)果一致。在超聲提示軟指標(biāo)或結(jié)構(gòu)異常而核型分析未見明顯異常的胎兒中，CNV-seq檢測出5例致病性異常，3例可能致病性異常。其中包括1例22q11微缺失綜合征，1例22q11微重復(fù)綜合征，1例小兒巨腦畸形綜合征合并過度生長綜合征，1例2q33.1微缺失綜合征，1例角膜營養(yǎng)不良綜合征。我們認(rèn)為，規(guī)范的產(chǎn)前診斷超聲檢查可發(fā)現(xiàn)胎兒微小的結(jié)構(gòu)異常，染色體核型分析有漏診的可能性，而使用CNV-seq可提高染色體亞顯微結(jié)構(gòu)上的異常檢出率。

綜上所述，本研究通過聯(lián)合應(yīng)用G顯帶染色體核型分析和CNV-seq檢測技術(shù)，比較了二者對不同染色體異常檢出的優(yōu)勢和局限性，分析了不同高危產(chǎn)前診斷指征與染色體異常的關(guān)系，認(rèn)為二者聯(lián)合檢測可提高臨床產(chǎn)前診斷的準(zhǔn)確性，尤其對于多指標(biāo)異常的高危孕婦，可有效預(yù)防出生缺陷。但本文也有不足之處，超聲相關(guān)產(chǎn)前診斷指征有待于分類分析以及對胎兒出生后的進一步隨訪驗證。我國2019年4月發(fā)表專家共識認(rèn)為有產(chǎn)前診斷條件的單位可將CNV-seq作為一線產(chǎn)前診斷技術(shù)應(yīng)用于臨床[18]。然而致病性未知的CNV-seq檢測結(jié)果以及因部分CNV導(dǎo)致的疾病存在表現(xiàn)度與外顯率的差異，受限于目前醫(yī)學(xué)對疾病的認(rèn)知，也給臨床咨詢帶來不確定性，也使得患者及家庭產(chǎn)生不必要焦慮的心理，同時對醫(yī)學(xué)倫理帶來挑戰(zhàn)。因此，應(yīng)充分告知孕婦CNV-seq技術(shù)的適用范圍與局限性，使其在充分知情的前提下自主選擇。