談丹丹，柴競艷，劉建云，聶紅兵，熊 暉，吳向斌*

(1.九江學(xué)院附屬醫(yī)院 神經(jīng)內(nèi)科；2.九江學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，江西省系統(tǒng)生物醫(yī)學(xué)重點實驗室，江西 九江332000；3.北京大學(xué)第一醫(yī)院 兒科，北京100034)

LMNA(lamin A)基因編碼A型核纖層蛋白，主要為核纖層蛋白A/C。核纖層蛋白A/C在體細胞廣泛表達，分布于細胞核內(nèi)膜下層，是細胞核骨架的重要組成部分,參與核孔復(fù)合體與核膜蛋白的錨定、細胞核的運動與定位、DNA轉(zhuǎn)錄與損傷修復(fù)等重要過程[1-2]。LMNA-相關(guān)先天性肌營養(yǎng)不良(LMNA-related congenital muscular dystrophy, L-CMD)是一類由LMNA突變導(dǎo)致肌營養(yǎng)不良亞型[3]。L-CMD患者肌纖維結(jié)構(gòu)嚴重破壞，肌細胞核形態(tài)顯著異常，核內(nèi)異染色質(zhì)濃縮，可見核膜局灶缺失、核帶、核仁裂，細胞核周圍線粒體形態(tài)異常且排列紊亂[4]。機械應(yīng)激致病假說提出：LMNA突變導(dǎo)致SUN1、Emerin蛋白、核纖層蛋白B1、核纖層蛋白B2等核內(nèi)膜下蛋白發(fā)生表達與分布異常，使得細胞核脆性增加，增加了肌肉組織的機械應(yīng)激[5]?；蛘{(diào)控致病假說認為：LMNA突變影響DNA損傷修復(fù)及基因表達調(diào)控[6]，導(dǎo)致肌細胞增殖及分化障礙。但是，核纖層蛋白A/C異常導(dǎo)致L-CMD發(fā)病的具體機制尚未完全明確。為進一步了解LMNA突變導(dǎo)致L-CMD的致病機制，本研究構(gòu)建LMNA野生型與突變體真核表達載體，轉(zhuǎn)染HEK293與C2C12細胞，構(gòu)建細胞模型，進一步構(gòu)建了LMNA突變體慢病毒載體，轉(zhuǎn)染C2C12，為LMNA突變體功能研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

人胚腎細胞系HEK293(ATCC細胞庫)；小鼠成肌細胞系C2C12(南昌大學(xué)第一附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科洪道俊教授饋贈)；pEGFP-N1質(zhì)粒(北京大學(xué)中心實驗室)；含人類LMNA全長cDNA的質(zhì)粒pEGFP-N1-LMNA及突變體質(zhì)粒pEGFP-N1-LMNA-I373V(北京大學(xué)第一醫(yī)院兒科實驗室構(gòu)建及保存)；Lipofectamine 2000、大腸桿菌菌株DH5α(Invitrogen公司)；DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清(Gibco公司)；限制性內(nèi)切酶(Thermo Fisher Scientific公司)；無縫克隆試劑盒(BBI Life Sciences公司)；質(zhì)粒提取試劑盒[天根生化科技(北京)有限公司]；兔源核纖層蛋白A/C一抗(10298-1-AP)、羊抗兔耦聯(lián)Cy3標(biāo)記二抗(Proteintech公司)；Hoechst33342(HY-15559A)(MedChemExpress公司)。引物合成與基因測序、pHBLV-GFP-PURO慢病毒穿梭質(zhì)粒、pSPAX2與pMD2G[明琛志遠生物技術(shù)(北京)有限公司]。

1.2 方法

1.2.1 野生型全長LMNA cDNA和突變體真核表達載體的構(gòu)建： 根據(jù)目的基因及載體序列設(shè)計擴增引物，構(gòu)建pEGFP-N1-LMNA。PCR擴增LMNA cDNA的PCR反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性2.5 min，94 ℃變性30 s、56 ℃退火30 s、68 ℃延伸2 min，共30個循環(huán)，68 ℃延伸5 min。將PCR產(chǎn)物及pEGFP-N1質(zhì)粒用EcoRⅠ和BamHⅠ進行37 ℃酶切3 h，混合于T4連接酶反應(yīng)液中孵育1.5 h，轉(zhuǎn)化感受態(tài)DH5α，克隆，質(zhì)粒提取與測序鑒定。以pEGFP-N1-LMNA為模板，構(gòu)建c.1117A>G定點突變質(zhì)粒pEGFP-N1-LMNA-I373V。定點突變PCR反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性2.5 min，94 ℃變性30 s、56 ℃退火30 s、68 ℃延伸1 min，共20個循環(huán)，68 ℃延伸5 min。酶切、連接及轉(zhuǎn)化感受態(tài)DH5α，克隆，質(zhì)粒提取與測序鑒定。

1.2.2 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染與G418抗性克隆篩選： HEK293與C2C12分別接種于24孔板，待細胞增殖至匯合70%時進行pEGFP-N1-LMNA、pEGFP-N1-LMNA-I373V質(zhì)粒轉(zhuǎn)染：A液為150 μL無血清DMEM+5 μL lip2000，混勻后靜置5 min，B液為150 μL無血清DMEM+5 μg質(zhì)粒DNA，A液和B液混勻，室溫靜置20 min，將混合液吸入24孔板，放于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，20 h后熒光顯微鏡下觀察，利用GFP標(biāo)記核纖層蛋白A/C，Hoechst33342標(biāo)記細胞核。

C2C12細胞接種于24孔板，按上述方法進行細胞轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染16 h后換液，培養(yǎng)液含G418濃度為1 000 mg/L，10 d后細胞成簇增殖，運用極限稀釋法挑取單克隆入96孔板繼續(xù)G418篩選培養(yǎng)2周，轉(zhuǎn)入24孔板擴大培養(yǎng)。利用GFP標(biāo)記核纖層蛋白A/C，熒光顯微鏡下觀察核纖層蛋白A/C亞細胞定位。

1.2.3 突變體慢病毒載體的構(gòu)建： 以pEGFP-N1-LMNA-I373V為模板，上游引物F：5′-GGATCTATT TCCGGTGAATTCGCCACCATGGAGACCCCGTCCCAG C-3′，下游引物R：5′-TAAGCTTGGTACCGAGGATC CCGAGCTGCAGTTCTGGG-3′，進行PCR擴增，用EcoRⅠ、BamHⅠ酶切，膠回收的PCR片段與載體連接，轉(zhuǎn)化感受態(tài)DH5a，37 ℃培養(yǎng)過夜。轉(zhuǎn)化后平板挑菌，37 ℃ 250 r/min搖菌14 h，陽性克隆進行測序鑒定。pHBLV-LMNA-I373V-3*flag-GFP-PURO慢病毒穿梭質(zhì)粒、pSPAX2與pMD2G共轉(zhuǎn)染293T細胞，轉(zhuǎn)染后6 h更換為完全培養(yǎng)基，培養(yǎng)48和72 h后，收集富含慢病毒顆粒的細胞上清液，4℃ 2 000×g離心10 min，去除細胞碎片，然后收集病毒上清液，4℃ 82 700×g離心120 min，得到高滴度慢病毒超離液，進行慢病毒滴度測定。

1.2.4 慢病毒轉(zhuǎn)染C2C12： C2C12細胞接種于24孔板，待細胞增殖至匯合70%時行慢病毒轉(zhuǎn)染，準(zhǔn)備6個1.5 mL離心管，第一個離心管中加入100 μL病毒液，然后做3倍梯度稀釋，共6個稀釋度，再向每管加入適量DMEM配制成300 μL+4 μL慢病毒轉(zhuǎn)染增強劑，分別加入對應(yīng)孔，轉(zhuǎn)染24 h后更換完全培養(yǎng)基，培養(yǎng)5 d，熒光顯微鏡下觀察細胞綠色熒光信號良好。6 μg/mL嘌呤霉素篩選3 d，小部分細胞存活，綠色熒光信號強，運用極限稀釋法挑取單克隆入96孔板繼續(xù)2 μg/mL嘌呤霉素篩選培養(yǎng)2周，轉(zhuǎn)入24孔板擴大培養(yǎng)。采用核纖層蛋白A/C特異性免疫熒光染色與Hoechst33342染色，觀察核纖層蛋白A/C亞細胞定位及細胞核大小。

2 結(jié)果

2.1 野生型LMNA cDNA與突變體真核表達載體測序

對pEGFP-N1-LMNA與pEGFP-N1-LMNA-I373V融合質(zhì)粒進行測序驗證，測序結(jié)果與目的基因序列完全一致，c.1117A>G突變位點及周圍序列(圖1)。

2.2 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染與核纖層蛋白A/C亞細胞定位

對轉(zhuǎn)染的HEK293及C2C12進行免疫熒光觀察，野生型質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的細胞內(nèi)核纖層蛋白A/C均勻表達于核膜下，突變體質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的細胞內(nèi)核纖層蛋白A/C表達于核中間，呈點狀異常散在分布(圖2)，C2C12轉(zhuǎn)染效率(25%)明顯低于HEK293轉(zhuǎn)染效率(97%)(圖2, 3)。pEGFP-N1-LMNA與pEGFP-N1-LMNA-I373V轉(zhuǎn)染C2C12后繼續(xù)G418篩選培養(yǎng)，免疫熒光觀察G418篩選后的細胞內(nèi)核纖層蛋白A/C亞細胞定位改變與瞬時轉(zhuǎn)染基本一致(圖4)。

2.3 慢病毒表達載體鑒定與滴度測定

pHBLV-h-LMNA-I373V-3*flag-GFP-PURO進行測序驗證，測序結(jié)果與目的基因序列完全一致。對包裝的慢病毒表達載體進行滴度測定，結(jié)果為pHBLV-LMNA-I373V-3*flag-GFP-PURO：2×108TU/mL，pHBLV-GFP-PURO：1×108TU/mL。

Arrows showed the site of LMNA c.1117A圖1 pEGFP-N1-LMNA與pEGFP-N1-LMNA-I373V中c.1117A位點及周圍序列Fig 1 The sequences around c.1117A in pEGFP-N1-LMNA and pEGFP-N1-LMNA-I373V

A.HEK293 cells were transfected by pEGFP-N1; B.HEK293 cells were transfected by pEGFP-N1-LMNA; C.HEK293 cells were transfected by pEGFP-N1-LMNA-I373V; GFP-labeled lamin A/C

圖2 野生型及突變體瞬時轉(zhuǎn)染HEK293細胞
Fig 2 HEK293 cells were transfected by the wild and mutant constructs respectively

2.4 慢病毒載體轉(zhuǎn)染C2C12細胞

pHBLV-h-LMNA-I373V-3*flag-GFP-PURO、pHBLV- GFP-PURO轉(zhuǎn)染的C2C12細胞進行免疫熒光觀察，pHBLV-GFP-PURO轉(zhuǎn)染的細胞核大小一致、形態(tài)規(guī)則，核纖層蛋白A/C在核內(nèi)均勻分布；突變體慢病毒轉(zhuǎn)染的細胞核大小不一，核纖層蛋白A/C在核內(nèi)分布不均勻(圖5)。

3 討論

LMNA定位于染色體1q21.1～21.3，主要編碼核纖層蛋白A/C。核纖層蛋白A/C與多種核骨架蛋白連接，使核纖層蛋白、核內(nèi)膜、核孔復(fù)合體緊密連接，發(fā)揮“腳手架”作用，參與形成細胞核-細胞質(zhì)骨架結(jié)構(gòu)[7]。LMNA導(dǎo)致的L-CMD在先天性肌營養(yǎng)不良中占4.2%～8.8%[8-10]。L-CMD肌肉病理呈肌營養(yǎng)不良樣改變或肌肉病樣改變，伴大量炎癥細胞浸潤，電鏡下肌細胞核形態(tài)異常、核膜損害、肌纖維結(jié)構(gòu)破壞[11]。

曾報道了一例LMNA c.1117A>G雜合突變導(dǎo)致的L-CMD呈炎性反應(yīng)肌病樣改變，電鏡下顯示肌細胞核損害。為進一步研究此突變導(dǎo)致L-CMD的發(fā)病機制，構(gòu)建了野生型pEGFP-N1-LMNA、突變體pEGFP-N1-LMNA-I373V融合質(zhì)粒。由于核纖層蛋白A/C在各組織細胞廣泛表達，且HEK293細胞轉(zhuǎn)染效率高，本研究選取HEK293進行突變體功能的初步研究?？紤]HEK293不能完全解釋L-CMD中肌細胞損害機制，進一步選擇了目前常用于遺傳性肌病研究的肌細胞系C2C12來構(gòu)建突變體細胞模型。

A, B, E, F.C2C12 cells after transfecttion with pEGFP-N1-LMNA; C, D, G, H.C2C12 cells after transfecttion with pEGFP-N1-LMNA-I373V; GFP-labeled lamin A/C, nucleus were stained by Hoechest33342；I373V -1，I373V-2.wild type-1 and wild type-2 were two different visual fields of the same sample

圖3 野生型及突變體瞬時轉(zhuǎn)染C2C12細胞
Fig 3 C2C12 cells were transfected by the wild and mutant constructs respectively

A.C2C12 cells after transfecttion with pEGFP-N1-LMNA selected with G418; B, C. C2C12 cells after transfecttion with pEGFP-N1-LMNA-I373V selected with G418; GFP-labeled lamin A/C

圖4 G418篩選后的野生型與突變體質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的C2C12細胞
Fig 4 C2C12 cells were transfected by the wild and mutant constructs selected with G418

正常情況下，核纖層蛋白A/C均勻分布于細胞核內(nèi)膜下層。突變體轉(zhuǎn)染的HEK293與C2C12細胞均顯示核纖層蛋白A/C在細胞核內(nèi)呈散點樣分布，表明LMNA突變導(dǎo)致核纖層蛋白A/C亞細胞定位改變。C2C12細胞轉(zhuǎn)染效率明顯低于HEK293，用G418篩選轉(zhuǎn)染后的C2C12，熒光觀察突變體轉(zhuǎn)染的C2C12細胞核大小不一、形態(tài)不規(guī)則，核纖層蛋白A/C在核內(nèi)散點樣分布，結(jié)果與瞬時轉(zhuǎn)染一致。但隨著細胞傳代，熒光亮度逐漸減弱，提示轉(zhuǎn)染細胞內(nèi)核纖層蛋白A/C表達逐漸下降。為提高C2C12轉(zhuǎn)染效率及穩(wěn)定表達突變的蛋白，進一步構(gòu)建了突變體慢病毒載體轉(zhuǎn)染C2C12細胞，免疫熒光染色結(jié)果與質(zhì)粒轉(zhuǎn)染一致，且轉(zhuǎn)染效率明顯提高，核纖層蛋白A/C表達更穩(wěn)定，提示慢病毒比pEGFP-N1質(zhì)粒更適合用于LMNA突變體C2C12模型構(gòu)建。

A, B, C.C2C12 cells after transfecttion with pHBLV-GFP-PURO; D, E, F.C2C12 cells were transfected by pHBLV-h-LMNA-I373V-3*flag-GFP-PURO; red was immunafluorescence staining using 10298-1-AP; GFP-1,GFP-2.transfection of lentivirus labeled by GFP, cells of GFP-1 group were treated by immunaluorescence as A and D, cells of GFP-2 group with 100% confluence were untreated by immunafluorescence

圖5 慢病毒轉(zhuǎn)染的C2C12細胞
Fig 5 C2C12 cells after transfection with the lentivirus

本研究證實了LMNA c.1117A>G突變可導(dǎo)致細胞核形態(tài)改變及核纖層蛋白A/C核內(nèi)定位異常。目前認為，LMNA突變導(dǎo)致核纖層蛋白A/C在肌細胞核內(nèi)錯誤定位，繼而改變核膜蛋白網(wǎng)絡(luò)及細胞骨架結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致肌細胞與細胞核機械應(yīng)激增加，使肌細胞壞死與凋亡增加[5-6]。研究表明，炎性反應(yīng)機制可能是L-CMD發(fā)病的重要機制[12-13]。最新研究發(fā)現(xiàn)，L-CMD模型鼠的肌肉病理呈炎性反應(yīng)肌病樣改變，符合L-CMD患者炎癥反應(yīng)肌肉病理改變特點[14]。目前，肌細胞核畸形與炎性反應(yīng)之間如何相互作用仍不明確。構(gòu)建L-CMD細胞模型進行LMNA突變功能研究，有助于深入認識L-CMD的致病機制，可能為該病的治療研究提供新思路。