胡景岑，李 鏈，王淑瑜，許 磊，楊德倫，韓麗媛*，許國(guó)棟,2*

(1.寧波大學(xué) 浙江省病理生理學(xué)技術(shù)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江 寧波 315211； 2.寧波市醫(yī)療中心李惠利醫(yī)院病案室，浙江 寧波 315211)

缺血性卒中(ischemic stroke)是腦部缺血引起腦組織損傷的一種急性腦血管疾病，2016年中國(guó)缺血性卒中發(fā)病率已經(jīng)達(dá)到276.75/10萬[1]。

高同型半胱氨酸血癥 (hyperhomocysteinemia，Hhcy)是卒中發(fā)病的一個(gè)重要危險(xiǎn)因素。絲氨酸羥甲基轉(zhuǎn)移酶 (serine hydroxymethyltransferase 1，SHMT1)的表達(dá)減少可以引起葉酸代謝受阻及同型半胱氨酸(homocysteine, Hcy)再甲基化途徑出現(xiàn)異常，進(jìn)而造成Hhcy。

DNA甲基化是一種可遺傳的、可逆的在DNA 序列上發(fā)生甲基化修飾來調(diào)控基因表達(dá)的過程，進(jìn)而影響蛋白結(jié)合[2]。異常的DNA甲基化與卒中[3]有密切關(guān)系，但國(guó)內(nèi)外未見SHMT1基因甲基化與卒中的關(guān)系的研究。本研究通過檢測(cè)290名健康人群和141例缺血性卒中患者的SHMT1基因啟動(dòng)子甲基化水平, 分析SHMT1啟動(dòng)子甲基化與缺血性卒中間的關(guān)聯(lián), 為預(yù)防缺血性卒中發(fā)病提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 研究對(duì)象：本次研究對(duì)象來源于慢性病管理系統(tǒng)中登記的290名健康對(duì)照組和141例缺血性卒中病例組。納入標(biāo)準(zhǔn)為在深圳居住滿6個(gè)月且已在社區(qū)健康服務(wù)中心建立健康檔案的漢族居民，且均為年滿20歲的原發(fā)性高血壓患者。原發(fā)性高血壓的定義為3次血壓測(cè)量的平均值，收縮壓在 140 mmHg以上且舒張壓在 90 mmHg以上，或者正在服用降壓藥物的患者。排除標(biāo)準(zhǔn)為繼發(fā)性高血壓患者、惡性腫瘤患者、嚴(yán)重肝腎疾病患者、妊娠者，或者有服用葉酸或維生素B6或B12史。所有受試者在納入研究前均被詳細(xì)告知實(shí)驗(yàn)的目的、方法，并簽署知情同意書。本研究已通過深圳南山慢性病防治院和寧波大學(xué)醫(yī)學(xué)院倫理委員會(huì)審核(文號(hào)：1120170008)。

1.1.2 試劑：EZ DNA Methylation-GoldTM kit試劑盒(Zymo Research公司)；methylated陽性參照 (QIAGEN公司)；酶Light Cycler? 480 SYBR Green Ⅰ Master Mix試劑盒(Roche 公司)。

1.2 方法

1.2.1 基線資料的收集：所有參與的調(diào)查員均經(jīng)過統(tǒng)一培訓(xùn)，按既定方案對(duì)納入人群進(jìn)行問卷調(diào)查、體格檢查和實(shí)驗(yàn)室檢查。問卷調(diào)查包含年齡、性別、吸煙和飲酒情況、抑郁情況等人口學(xué)資料；體格檢查包含身高、體質(zhì)量、血壓、腰臀比(waist hip ratio, WHR)；實(shí)驗(yàn)室檢查包含Hcy、三酰甘油(triglyceride, TG)、總膽固醇(total cholesterol, TC)、低密度脂蛋白(low density lipoprotein, LDL)、空腹血糖(blood glucose, Glu)和尿酸(uric acid, UA)等生化指標(biāo)。

1.2.2 DNA的提取和轉(zhuǎn)化：空腹12 h后，抽取5 mL靜脈血到EDTA抗凝管，血液在采集后立即置于低溫采樣箱移送到實(shí)驗(yàn)室，如不能立即進(jìn)行下步實(shí)驗(yàn)則將血液保存到-80 ℃超低溫冰箱。外周血DNA主要通過NP968-S核酸提取儀及其配套試劑盒自動(dòng)提取。采用Multiskan GO紫外分光光度計(jì)自動(dòng)檢測(cè)DNA的濃度及質(zhì)量。DNA亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)化采用EZ DNA Methylation-GoldTM kit試劑盒。

1.2.3 RT-qPCR檢測(cè)SHMT1基因啟動(dòng)子甲基化水平：利用 NCBI 數(shù)據(jù)庫及甲基化在線分析軟件(UCSC)搜索 SHMT1基因啟動(dòng)子區(qū)域的CpG島，確定CpG島的位置及 DNA 檢測(cè)片段，并獲取相應(yīng)的DNA 序列，通過PyroMark Assay Design Software 2.0 軟件確定檢測(cè)片段并進(jìn)行引物設(shè)計(jì)，具體引物序列見表1。甲基化水平的檢測(cè)采用熒光定量甲基化特異性PCR。將經(jīng)過亞硫酸氫鹽修飾過樣本DNA以及EpiTect Control DNA，methylated陽性參照作為模板，選擇以人ACTB基因作為實(shí)驗(yàn)內(nèi)參基因，應(yīng)用SYBR Green 熒光染料法，采用的實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀和試劑盒檢測(cè)樣本中目的基因甲基化水平。反應(yīng)體系為1.5 μL亞硫酸鹽轉(zhuǎn)化后的DNA、 0.5 μL的正向引物、0.5 μL的反向引物、10 μL Zymo TaqTMPreMix和7.5 μL DNAase/RNAase-free water。PCR擴(kuò)增的條件為95 ℃預(yù)變性10 min；95 ℃變性解鏈20 s，58 ℃退火45 s，72 ℃延伸20 s，共45個(gè)循環(huán)；40 ℃延伸5 min，于4 ℃保存。待測(cè)樣本的DNA序列完成PCR擴(kuò)增后，采用Qsep100 DNA分析儀進(jìn)行甲基化水平檢測(cè)。

1.2.4 SHMT1基因甲基化水平與相關(guān)mRNA表達(dá)水平關(guān)聯(lián)性的分析： 530個(gè)樣本SHMT1基因甲基化數(shù)據(jù)來源于The Cancer Genomics Browser (UCSC; https://genome-cancer.ucsc.edu/)。與之相應(yīng)的mRNA表達(dá)數(shù)據(jù)來源于The cBioPortal database (http://www.cbioportal.org/)。采用Pearson相關(guān)探究SHMT1基因甲基化水平與相關(guān)mRNA表達(dá)水平間關(guān)聯(lián)強(qiáng)度。

表1 qMSP引物序列Table 1 Primers sequence of qMSP

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 基線資料分析

在290名對(duì)照組和141例卒中組中，性別、UA、TG、TC、WHR、吸煙和抑郁狀況中無差異。卒中組的年齡、Hcy、BMI、SBP、DBP、Glu均高于對(duì)照組(P<0.05)。卒中組的LDL低于高血壓組(P<0.05)。高血壓組的飲酒情況高于卒中組(P<0.05)(表2)。

2.2 兩組間DNA 甲基化水平比較

本研究選擇SHMT1啟動(dòng)子片段位于hg19, Chr17:18266824-18266911，片段中有6個(gè)CpG島(圖1)。SHMT1基因啟動(dòng)子甲基化在卒中組和對(duì)照組中呈非正態(tài)分布。結(jié)果發(fā)現(xiàn)卒中組SHMT1基因啟動(dòng)子甲基化水平高于對(duì)照組 (P<0.05)(表2)。

表2 研究對(duì)象的基線資料比較Table 2 Characteristics comparison of study

*P<0.05 compared with control.

圖1 SHMT1啟動(dòng)子區(qū)域目標(biāo)片段Fig 1 Characteristics of target sequences in SHMT1 gene promoter

2.3 相關(guān)因素和SHMT1基因甲基化相關(guān)性分析

在對(duì)照組UA與SHMT1甲基化相關(guān)(P<0.01)，在卒中組發(fā)現(xiàn)TG與SHMT1甲基化相關(guān)(P<0.05)(表3)。

表3 相關(guān)因素和SHMT1甲基化Spearman秩相關(guān)性分析

*P<0.05,**P<0.01.

2.4 不同亞組中SHMT1甲基化與卒中的關(guān)系

二分類Logistic回歸分析結(jié)果顯示在調(diào)整年齡、性別、BMI、Hcy、UA、TC、TG、LDL、Glu、WHR、SBP、DBP、吸煙、飲酒和抑郁狀態(tài)等變量后，SHMT1甲基化是卒中的危險(xiǎn)因素。在進(jìn)一步的亞組分析中發(fā)現(xiàn)，在男女組中，SHMT1甲基化均是卒中的危險(xiǎn)因素，且性別和基因甲基化對(duì)卒中存在交互作用。結(jié)果還表明不同同型半胱氨酸血水平和基因甲基化對(duì)卒中存在交互作用(表4)。

2.5 ROC曲線分析

ROC曲線下面積為0.804，95%CI=0.760～0.849 (P<0.01)。

2.6 SHMT1甲基化水平與相關(guān)mRNA表達(dá)水平關(guān)聯(lián)性分析

進(jìn)一步下載數(shù)據(jù)庫數(shù)據(jù)分析SHMT1甲基化與相關(guān)mRNA表達(dá)水平的關(guān)聯(lián)性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)SHMT1甲基化表達(dá)與mRNA的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，r=-0.472，P<0.01。

3 討論

缺血性卒中是遺傳因素和環(huán)境因素共同作用的一種疾病，其發(fā)病機(jī)制異常復(fù)雜。動(dòng)脈粥樣硬化的形成和發(fā)展是缺血性卒中重要的病理生理基礎(chǔ)，約有68%以上的缺血性卒中患者存在不同程度的動(dòng)脈粥樣硬化[4]。近年來，越來越多的研究發(fā)現(xiàn)，DNA甲基化在卒中的發(fā)生發(fā)展過程中起著顯著作用[5-6]。

表4 SHMT1啟動(dòng)子甲基化水平與卒中的多元logistic回歸分析

crude.unadjusted; model 1.adjusted for age, gender, BMI, Hcy, UA, TC, TG, LDL, Glu, WHR, SBP, DBP, smoking, drinking, and psychology;*P-interaction<0.01:the interaction effect between different facters(gender, age, homocysteine) and SHMT1 methylation on strdce.

SHMT1是葉酸代謝過程中碳單元的重要提供者。SHMT1 基因高甲基化通過降低SHMT1的表達(dá)，進(jìn)而引起葉酸代謝受阻及Hcy再甲基化途徑出現(xiàn)異常，造成Hcy在血中蓄積而產(chǎn)生高同型半胱氨酸血癥。此外，細(xì)胞中SHMT1的沉默可以誘導(dǎo)抗氧化系統(tǒng)和氧化產(chǎn)物之間的不平衡，增加氧化應(yīng)激下游效應(yīng)因子(如MMP2等)[7]的表達(dá)，進(jìn)而引起血管鈣化和動(dòng)脈粥樣硬化[8]。本研究也在進(jìn)一步亞組分析中發(fā)現(xiàn)不同Hcy水平與SHMT1 基因甲基化對(duì)缺血性卒中存在交互作用。

性別與SHMT1基因甲基化對(duì)缺血性卒中也存在交互作用，女性中SHMT1基因甲基化的OR值高于男性。在以往研究中也有報(bào)道，心血管疾病相關(guān)基因甲基化在性別上存在差異[9]?？赡茉蚴悄信g性激素水平存在差異，性激素可以修飾DNA甲基化水平[10]。此外，先前在全基因組DNA甲基化的研究中也發(fā)現(xiàn)不同性別基因組甲基化水平存在差異[11]，有學(xué)者認(rèn)為這種差異是由于男女中葉酸和一碳單位的攝入量存在差異引起的[12]。

在國(guó)外一項(xiàng)單核苷酸多態(tài)性分析中發(fā)現(xiàn)SHMT1 rs1979277在卒中組和正常對(duì)照組間基因型存在著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，其中等位基因A是卒中的風(fēng)險(xiǎn)等位基因。在新加坡華裔中進(jìn)行的研究中發(fā)現(xiàn)SHMT1 rs11868708位點(diǎn)與卒中遺傳易感性相關(guān)，等位基因A可以增加24%的卒中危險(xiǎn)[13]。此外，在本課題組前期進(jìn)行的一項(xiàng)病例研究中發(fā)現(xiàn)HMT1高甲基化是高血壓的危險(xiǎn)因素之一[14]。本研究在調(diào)整相關(guān)混雜因素后也發(fā)現(xiàn)SHMT1甲基化是缺血性卒中的危險(xiǎn)因素。

綜上所述，SHMT1甲基化與缺血性卒中相關(guān)聯(lián)，且SHMT1甲基化可以作為診斷缺血性卒中潛在的生物標(biāo)志物，通過檢測(cè)SHMT1甲基化水平對(duì)缺血性卒中高危人群進(jìn)行篩選，以期達(dá)到二級(jí)預(yù)防的目的。