漢聰慧，曹廣進，張福真，胡亮杉，曹東林*，李 凌*

(1.南方醫(yī)科大學 公共衛(wèi)生學院 三級生物安全實驗室，廣東 廣州 510515； 2.廣州市番禺區(qū)疾病預防控制中心，廣東 廣州 511400; 3.廣東省第二人民醫(yī)院 臨床檢驗中心，廣東 廣州 510317)

感染性腹瀉廣義指各種病原體腸道感染引起的腹瀉，除外霍亂、細菌性和阿米巴痢疾、傷寒和副傷寒的感染性腹瀉[1]。據(jù)估計，2016年全球共有40億感染性腹瀉患者，其中160萬患者死亡。發(fā)展中國家的兒童最容易受到影響[2-3]。截至2017年，約53萬名5歲以下兒童因腹瀉而死亡[4]，其中大部分發(fā)生在世界上最貧窮的國家。國家衛(wèi)生健康委員會公布，2018年中國感染性腹瀉病發(fā)病率為92/10萬，病死率為0.001/10萬。

多種細菌、病毒均可引起感染性腹瀉病，且存在2種或2種以上的病毒或(和)細菌混合感染的情況[5]。研究表明，一年內(nèi)中國5歲以下兒童出現(xiàn)腹瀉病原體的混合感染可達到27.60%[5]。腹瀉病患者數(shù)量大、病原體復雜且多混合感染，目前中國腸道門診常規(guī)檢測包括的感染性腹瀉病原體種類有限，特殊檢測周期長，存在一定的局限性。液相芯片具有高通量、快速、可靠和經(jīng)濟等特點，可實現(xiàn)臨床快速確診[6]。因此，本研究運用液相芯片技術快速檢測感染性腹瀉病病原體，分析檢出病原體特征，并與實時熒光定量PCR比較，評價其在感染性腹瀉病快速診斷中的應用前景。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品來源：糞便樣品來自于2017年11月至12月廣東省第二人民醫(yī)院門診就醫(yī)的96例兒童及0月～5歲嬰幼兒腹瀉患者，其中男性54例、女性42例，年齡中位數(shù)為2.05歲。就診前患兒未服用抗生素、抗病毒及抗阿米巴藥物。本研究獲得醫(yī)院倫理委員會批準(批準文號：2017-SCZYF-JYK)。

1.1.2 試劑：胃腸道病原體檢測試劑盒(Luminex公司)；核酸抽提試劑盒(Qiagen公司)；樣品預處理緩沖液(Biomerieux公司)；Bertin SK38糞便核酸提取微珠試管(Bertin公司)；質(zhì)粒小提試劑盒、切膠回收試劑盒、pMD 19-T載體及氨芐青霉素(TaKaRa公司)。

1.2 方法

1.2.1 糞便標本的預處理：將100～150 mg糞便樣品添加到含Bertin SK38微珠的糞便樣品裂解液中。每份樣品加入10 μL的xTAG?MS2作為液相芯片檢測的內(nèi)參對照。將預處理試管渦旋5 min，室溫下靜置10～15 min，再以14 000 r/min離心2 min，得到樣品上清液。

1.2.2 核酸的提?。喝?00 μL的樣品上清液，按照核酸抽提試劑盒說明書進行操作，最終得到60 μL核酸洗脫液。

1.2.3 液相芯片檢測

1.2.3.1 多重RT-PCR反應：每個反應管中加入xTAG?RNase-free水2.5 μL、5×xTAG?OneStep RT-PCR緩沖液7.5 μL、xTAG?GPP 引物混合物2.5 μL、xTAG?BSA(10 mg/mL)0.5 μL和xTAG?OneStep 酶混合物2.0 μL，共15 μL，配制96例樣品所需試劑量，同時設置陰性對照。再加入96例樣品核酸洗脫液10 μL/管，陰性對照中加入xTAG?RNase-free水10 μL。將配好的各PCR管短暫離心。在PCR儀中以53 ℃ 20 min，1個循環(huán)；95 ℃ 15 min，1個循環(huán)；95 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，38個循環(huán)；72 ℃ 2 min，1個循環(huán)，進行多重RT-PCR反應。

1.2.3.2 多重PCR產(chǎn)物與微球雜交反應：在每個0.2 mL PCR管中加入xTAG?GPP Bead Mix 20 μL、1×SA-PE報告溶液75 μL、多重RT-PCR產(chǎn)物5 μL，配制成100 μL/管的雜交體系。最后，在提前預熱至60 ℃的PCR儀中以60 ℃ 3 min、45 ℃ 45 min進行分子雜交反應。

1.2.3.3 xTAG?GPP檢測：將PCR管放置于提前預熱至45 ℃的加熱器，檢測后使用xTAG?Data Analysis Software (TDAS) 軟件分析結(jié)果。

1.2.4 實時熒光定量PCR檢測：采用實時熒光定量PCR試劑盒(探針法)對1.2.2步驟所提取的核酸進行qPCR。qPCR檢測所用引物序列(表1)[7]，所用基因探針序列(表2)[7]。

1.2.5 多重PCR產(chǎn)物的克隆、測序分析：將多重PCR產(chǎn)物克隆到pMD19-T載體，轉(zhuǎn)化、挑取單菌落、擴大培養(yǎng)、進行菌液PCR、瓊脂糖凝膠電泳驗證，最后提取菌液質(zhì)粒送至公司進行測序、BLAST分析。

表1 實時熒光定量PCR引物Table 1 Primer sequence of real-time PCR

表2 實時熒光定量PCR探針序列Table 2 Gene probe sequence of real-time PCR

1.3 統(tǒng)計學分析

計數(shù)資料以例數(shù)n、百分率(%)表示，采用SPSS 20.0對液相芯片與實時熒光定量PCR的檢測結(jié)果進行配對計數(shù)資料的χ2檢驗，以敏感度和特異度、陰性預測值和陽性預測值為檢測指標。

2 結(jié)果

2.1 腹瀉病原體檢出情況

xTAG?GPP試劑盒共檢出7種病原體63例，陽性檢出率為65.63%(63/96)。其中檢出最多的是沙門氏菌48例(50.00%)，其次是空腸彎曲桿菌20例(20.83%)、A組輪狀病毒16例(16.67%)、諾如病毒14例(14.58%)、腸道腺病毒3例(3.13%)，產(chǎn)腸毒素型大腸桿菌和大腸桿菌O157均為2例(2.08%)，沒有檢出霍亂弧菌、小腸結(jié)腸炎耶爾森桿菌及志賀氏菌。實時熒光定量PCR檢出62例樣品為陽性，陽性檢出率為64.58%(62/96)。

2.2 兩種方法檢測結(jié)果的比較

4種病原體(包括沙門氏菌、A組輪狀病毒、諾如病毒和空腸彎曲桿菌)檢出率均有差異(P<0.05)；液相芯片檢測7種腹瀉病原體的敏感度、特異度、陰性預測值、陽性預測值(表3)；正確指數(shù)為82.76～97.62，表明液相芯片檢測腹瀉病原體的真實性較高。

表3 液相芯片和實時熒光定量PCR方法對每種腸道病原體檢測結(jié)果比較Table 3 Comparison of liquid-phase chip and real-time PCR method for detection of each intestinal pathogen

-.no data;p.positive;n.negative.

液相芯片與實時熒光定量PCR檢測結(jié)果相同的共有83例，一致率為86.46%(83/96)，其中真陰性占39.76%(33/83)，真陽性占60.24%(50/83)。對沙門氏菌、A組輪狀病毒、諾如病毒和空腸彎曲桿菌的kappa值分別為0.79、0.83、0.92和0.91，說明兩種方法的一致性好。

經(jīng)χ2檢驗分析可知，與實時熒光定量PCR相比，液相芯片檢測感染性腹瀉病原體的敏感度為100.00%，特異度為71.74%，陰性預測值和陽性預測值分別為100.00%和79.37% (χ2=53.73，P<0.05)。

2.3 混合感染檢出情況

在96例樣品中，液相芯片與實時熒光定量PCR檢出只感染一種病原體的樣品例數(shù)(百分率)分別為38例(39.58%)、39例(40.63%)，混合感染例數(shù)及病原體檢出種類見表4。液相芯片檢出的細菌混合感染為7例(7.29%)，病毒混合感染為1例(1.04%)，細菌病毒混合感染為17例(17.71%)；實時熒光定量PCR檢出的細菌混合感染為7例(7.29%)，病毒混合感染為1例(1.04%)，細菌病毒混合感染為15例(15.63%)。

3 討論

感染性腹瀉是全球的重要公共衛(wèi)生問題[8]。

表4 兩種方法對混合感染檢測效果Table 4 Detection of mixed infection by two methods

多種病原體如細菌、病毒和寄生蟲都能引起腹瀉，在發(fā)展中國家，沙門氏菌感染致腹瀉是兒童死亡的主要原因之一[9]。

本研究運用液相芯片對7種細菌和3種病毒進行快速、平行檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)患兒腹瀉中細菌性感染較多，這可能與區(qū)域季節(jié)性的細菌性流行相關[10]。腹瀉患兒糞便中沙門氏菌檢出率高達半數(shù)，這與報道結(jié)果[11]類似；其次為空腸彎曲菌，該厭氧菌對營養(yǎng)要求較高，臨床常規(guī)方法如細菌培養(yǎng)、生化鑒定等，耗時長達1周，因此，液相芯片技術對以空腸彎曲菌為代表的腸道厭氧菌的檢測極具優(yōu)勢[12]。本研究病毒性感染以A組輪狀病毒最多，其次為諾如病毒和腸道腺病毒，這與國內(nèi)報道的感染情況[13-14]一致。上述結(jié)果表明，液相芯片技術可有效用于感染性腹瀉病原體的快速檢測。

腹瀉病原體混合感染較常見。本研究液相芯片檢測出多種細菌或病毒或細菌和病毒的混合感染，其中沙門氏菌、空腸彎曲菌兩種細菌混合感染比例最高達72.00%(18/25)，這與報道的細菌性混合感染病原體類型相似[10]。面對混合感染時，實時熒光定量PCR不僅耗費大量的人力、物力，還可能會因病原體種類較多而延誤最佳治療時機，而液相芯片一次能檢測多種病原體，這對混合感染的腹瀉病的快速診斷具有重要意義。

本研究中同一份樣品用兩種方法檢出的一致率較高，且液相芯片的敏感度和特異度與報道結(jié)果[12]相似。對不一致樣品進行測序分析，結(jié)果顯示與qPCR檢出結(jié)果一致，表明液相芯片檢測中出現(xiàn)了1～3個病原體的誤檢。液相芯片的假陽性可能與產(chǎn)物的切膠回收、克隆等操作有關，或因上次擴增產(chǎn)物密閉不嚴致所用試劑、加樣槍、環(huán)境出現(xiàn)極微量或微量的非目的核酸污染?？刹扇〉拇胧┌幮詫φ盏脑O置，試劑、加樣槍和環(huán)境的預處理和分區(qū)操作等，實現(xiàn)腹瀉病原體的準確檢測。

綜上所述，無論是單一腹瀉病原體感染還是混合感染，與qPCR相比，液相芯片技術都顯示出了高通量、快速、準確的優(yōu)勢。液相芯片技術對臨床快速檢測腹瀉病原體具有積極意義。