張新然，張 弋，高慧兒，強(qiáng)兆艷，李詠梅

(1.天津市第一中心醫(yī)院 藥學(xué)部，天津 300192； 2.天津醫(yī)科大學(xué) 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院 藥理學(xué)系，天津 300070；3.天津醫(yī)科大學(xué) 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院 病原生物學(xué)系，天津 300070)

肝細(xì)胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)是當(dāng)今世界上最常見的原發(fā)性肝臟惡性腫瘤，其病死率居于惡性腫瘤病死率第2位[1]。HCC多伴肝內(nèi)或遠(yuǎn)處臟器轉(zhuǎn)移，無法行根治性手術(shù)治療，因此，藥物是晚期肝癌患者治療的主要手段之一。索拉非尼是晚期肝癌治療的靶向藥物，但由于藥物獲得性耐藥問題致使肝癌預(yù)后并沒有較大改善，HCC 5年生存率僅為5%～6%[2]。銜接蛋白Shc3(Src homolog and collagen homolog 3)隸屬于Shc家族一員。既往研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)Shc3在HCC組織中高表達(dá)，Shc3表達(dá)上調(diào)促進(jìn)HCC轉(zhuǎn)移[3]，然而，Shc3表達(dá)下調(diào)對HCC細(xì)胞凋亡的影響有待進(jìn)一步研究。Shc3在生長因子刺激的神經(jīng)母細(xì)胞瘤中可結(jié)合酪氨酸激酶受體，激活MAPK通路，抑制腫瘤細(xì)胞分化，促進(jìn)腫瘤增殖[4]。半數(shù)早期和大部分晚期肝癌患者中MEK/ERK激活的患者預(yù)后相對較差[5-6]。結(jié)合索拉非尼的藥理作用，其是一種有效的酪氨酸激酶抑制劑，因此，推測由Shc3介導(dǎo)的信號通路激活可能在索拉非尼耐藥中發(fā)揮重要作用。本研究將探討Shc3與HCC細(xì)胞凋亡及耐藥性之間的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 試劑

胎牛血清、DMEM培養(yǎng)液(Hyclone公司)；Shc3一抗(Santa Cruz公司)；β-actin一抗(Immuno Way Biotechnology公司)；p-MEK、MEK、p-ERK、ERK一抗和索拉菲尼(Cell Signaling Technology公司)；Shc3和18s rRNA引物(蘇州金唯智生物科技有限公司)；FastQuant RT kit反轉(zhuǎn)錄試劑盒(TianGen公司)；FITC Amexin V Apoptosis Potectin Kit (BD公司)；Cell Counting Kit-8(Dojindo公司)；人肝癌細(xì)胞系HCCLM3、HepG2 和Huh7均購自美國典型培養(yǎng)物保存中心(ATCC)；Shc3 穩(wěn)定下調(diào)和穩(wěn)定上調(diào)的HCC細(xì)胞系及其陰性對照細(xì)胞為本實(shí)驗(yàn)室留存細(xì)胞系[3]。

1.2 方法

1.2.1 Western blot 檢測目的蛋白表達(dá)：蛋白裂解液超聲裂解細(xì)胞，提取總蛋白并用Pierce BCA試劑盒測各樣本蛋白濃度，吸取等質(zhì)量蛋白加入終濃度1×SDS蛋白上樣緩沖液煮沸10 min，采用10% SDS-PAGE膠每孔上樣50 μg，室溫電泳120 V，1 h，250 mA于4 ℃轉(zhuǎn)膜90 min，5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，4 ℃孵育一抗過夜，第2天使用同源二抗室溫孵育1 h，ECL發(fā)光液顯色曝光。

1.2.2 Real-time PCR檢測Shc3 mRNA表達(dá)：使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。8聯(lián)管中配置如下20 μL反應(yīng)體系：cDNA模板200 ng，上下游引物以10 μmol/L的濃度加入1.2 μL，2×SuperReal PreMix Plus 10 μL，50×ROX Reference Dye 0.4 μL，用DEPC處理水補(bǔ)足至20 μL。熒光定量PCR引物序列見表1。將樣品送入ABI 7500 Fast real-time PCR儀中，設(shè)定的程序?yàn)?4 ℃ 30 s，94 ℃ 5 s，60 ℃ 1 min，進(jìn)行40個循環(huán)。

表1 Real-time PCR引物序列Table 1 Primer sequence of real-time PCR

1.2.3 凋亡實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞凋亡：正常消化細(xì)胞，用500 μL 冰PBS洗一次，4 ℃ 1 000 r/min離心10 min，棄掉上清液，100 μL 1×結(jié)合緩沖液重懸細(xì)胞，所有實(shí)驗(yàn)組樣本及FITC單陽樣本加入5 μL amexin-V-FITC溶液，所有實(shí)驗(yàn)組樣本及PI單陽樣本加入5 μL PI溶液，室溫避光靜置15 min，最后加入100 μL 1×結(jié)合緩沖液在1 h內(nèi)應(yīng)用流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果。

1.2.4 CCK-8法檢測細(xì)胞增殖：96孔板每孔接種4×103個細(xì)胞，24 h后給藥。Huh7細(xì)胞系組中索拉菲尼終濃度分別為1.25、2.5、5、10和20 μmol/L，HepG2細(xì)胞系組中索拉菲尼終濃度分別為2.5、5、10、20和40 μmol/L。加藥組每個濃度設(shè)置5個重復(fù)，不加藥DMSO組作為對照組。37 ℃，5% CO2條件下孵育48 h后，每孔加入100 μL CCK-8溶液(1∶10稀釋)37 ℃孵育3 h，酶標(biāo)儀檢測450 nm波長處吸光度[7]。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 人肝細(xì)胞癌系HCCLM3和HepG2細(xì)胞中Shc3下調(diào)效率

Shc3分別在HCCLM3和HepG2細(xì)胞中的mRNA和蛋白表達(dá)量較scramble組明顯下調(diào)(P<0.05)(圖1)。

2.2 Shc3表達(dá)下調(diào)促進(jìn)HCCLM3和HepG2細(xì)胞凋亡

與scramble組細(xì)胞相比，Shc3低表達(dá)組細(xì)胞凋亡比例增加(P<0.05)(圖2)。

2.3 Shc3表達(dá)下調(diào)降低HCCLM3和HepG2細(xì)胞中p-MEK、p-ERK蛋白表達(dá)

與scramble組細(xì)胞相比，Shc3低表達(dá)組細(xì)胞中MEK/ERK通路激活程度明顯降低(P<0.05)(圖3)。

2.4 Shc3表達(dá)上調(diào)增加Huh7和HepG2細(xì)胞對索拉菲尼耐受性

前期實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，Shc3在Huh7細(xì)胞中的表達(dá)量低于HCCLM3細(xì)胞[3]，因此在Huh7細(xì)胞中高表達(dá)Shc3。Shc3分別在Huh7和HepG2細(xì)胞中的mRNA和蛋白表達(dá)量較對照組pCDH細(xì)胞明顯上調(diào)(P<0.05)。以不同濃度索拉菲尼分別作用細(xì)胞48 h后，隨藥物濃度遞增兩組細(xì)胞存活率均遞減。但在同一藥物濃度下，Shc3過表達(dá)組細(xì)胞存活率明顯高于pCDH組細(xì)胞(P<0.05)(圖4)。

*P<0.05 compared with scramble group圖1 Real-time PCR和Western blot 檢測Shc3在HCCLM3(A)和HepG2(B)細(xì)胞中下調(diào)效率

*P<0.05 compared with scramble group圖2 凋亡實(shí)驗(yàn)檢測Shc3表達(dá)下調(diào)對HCCLM3(A)和HepG2(B)細(xì)胞凋亡的影響

*P<0.05 compared with scramble group圖3 Western blot檢測HCCLM3(A)和HepG2(B)細(xì)胞中MEK/ERK通路蛋白表達(dá)情況

2.5 Shc3表達(dá)上調(diào)提高Huh7和HepG2細(xì)胞中p-MEK、p-ERK蛋白表達(dá)

與pCDH組細(xì)胞相比，Shc3高表達(dá)組細(xì)胞中MEK/ERK通路激活程度明顯增強(qiáng)(P<0.05)(圖5)。

3 討論

Shc3與腫瘤的增殖、分化和轉(zhuǎn)移等密切相關(guān)，在腫瘤中的研究相對較少，只在神經(jīng)母細(xì)胞瘤和甲狀腺癌中有報(bào)道[4,8]。在神經(jīng)母細(xì)胞瘤TNB1細(xì)胞中，Shc3在被生長因子刺激的神經(jīng)母細(xì)胞瘤中可結(jié)合酪氨酸激酶受體，結(jié)合后的Shc3構(gòu)象變化激活MAPK通路，從而過表達(dá)Shc3抑制了細(xì)胞分化，低表達(dá)Shc3明顯抑制了小鼠體內(nèi)的神經(jīng)母細(xì)胞瘤TNB1的成瘤性，從而抑制腫瘤增殖[4]； 在甲狀腺癌FB2細(xì)胞中Shc3與Gab1結(jié)合從而招募PI3K的亞型p85 激活A(yù)KT通路，促進(jìn)腫瘤的增殖[8]。前期研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，Shc3在HCC腫瘤組織中的mRNA及蛋白表達(dá)水平均高于相應(yīng)癌旁組織，且Shc3高表達(dá)的HCC患者預(yù)后較差，體內(nèi)和體外促進(jìn)HCC轉(zhuǎn)移[3]。本研究結(jié)果進(jìn)一步表明，Shc3表達(dá)下調(diào)促進(jìn)HCC細(xì)胞凋亡。

*P<0.05 compared with pCDH group

*P<0.05 compared with pCDH group圖5 Western blot檢測Huh7(A)和HepG2(B)細(xì)胞中MEK/ERK通路蛋白表達(dá)情況

MEK/ERK信號傳導(dǎo)通路在HCC細(xì)胞中普遍激活，應(yīng)用Ras抑制劑通過阻礙MEK/ERK通路治療肝癌Hep3B、HLF和Hep40細(xì)胞株可誘導(dǎo)凋亡反應(yīng)，抑制HCC增殖[9]。在食管癌KYSE 150 細(xì)胞中，MIR-133A可以通過靶向EGFR抑制MEK/ERK通路，從而促進(jìn)細(xì)胞凋亡，提高放射治療的敏感性[10]。本研究發(fā)現(xiàn)Shc3表達(dá)下調(diào)抑制MEK/ERK通路的激活，從而促進(jìn)HCC凋亡，與報(bào)道一致。

索拉非尼是一種多靶點(diǎn)分子靶向藥物，在抗腫瘤方面具有雙重作用：一方面抑制MEK/ERK信號通路從而抑制腫瘤增殖；另一方面阻斷腫瘤新生血管的形成[11-12]。在PLC/PRF/5 和HepG2肝癌細(xì)胞中，索拉菲尼抑制MEK和ERK磷酸化，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，抑制腫瘤增殖[13]。本研究發(fā)現(xiàn)，Shc3在Huh7和HepG2中表達(dá)上調(diào)激活了MEK/ERK通路，降低了對靶向藥物索拉菲尼的敏感性。

綜上所述，本文結(jié)合前期研究基礎(chǔ)，從Shc3表達(dá)下調(diào)抑制MEK/ERK通路激活促進(jìn)HCC細(xì)胞凋亡的角度，進(jìn)一步證明Shc3過表達(dá)增加HCC細(xì)胞對索拉菲尼的耐藥性并激活MEK/ERK通路，繼而說明Shc3與肝細(xì)胞癌索拉菲尼耐藥之間的關(guān)聯(lián)，但具體的耐藥機(jī)制有待進(jìn)一步探究。本研究結(jié)果為靶向Shc3治療肝細(xì)胞癌提供了理論依據(jù)和實(shí)驗(yàn)室基礎(chǔ)。