周雅娟，開海麗，喬海風，張連鎖，吳劉成，劉穎蕾，劉曼華

子宮內膜異位癥（endometriosis，EMs）是一種常見的婦科疾病，指子宮內膜中的腺體和基質異位到子宮以外的部位，種植、生長形成異位病灶，常伴有盆腔痛、痛經、不孕等臨床表現[1]。目前尚無學說可以明確解釋EMs的發(fā)病機制。1921年Sampson提出“經血逆流學說”的同時提出子宮內膜也可以通過淋巴傳播[1]。不少學者在盆腔淋巴管、淋巴結中發(fā)現子宮內膜組織。有研究指出，在腹膜型及深部浸潤型EMs異位內膜中淋巴管數目大于正常組織，但尚無研究明確子宮內膜進入淋巴系統(tǒng)的機制?；|細胞衍生因子1（SDF-1）是趨化因子的一種，與其特異性受體趨化因子受體4（CXCR4）結合后在多種惡性腫瘤淋巴管新生、淋巴轉移中發(fā)揮重要作用[2-3]。D2-40是新近發(fā)現的最具特異性的新生淋巴管特異性標記物[4]，所標記出的淋巴管數目以微淋巴管密度（microlymphatic vessel density，MLVD）表示。EMs與惡性腫瘤有相似的生物學行為，因此本研究通過檢測正常內膜、在位內膜和異位內膜中SDF-1、CXCR4以及D2-40標記的MLVD，探討SDF-1、CXCR4在EMs淋巴管新生、子宮內膜細胞淋巴遷移中的意義。

1 對象與方法

1.1 研究對象選取2017年11月—2018年5月就診于南通大學第二附屬醫(yī)院的患者。試驗組為因卵巢型EMs行腹腔鏡下卵巢子宮內膜異位囊腫剝除術的患者（n=20），術前行診刮術取在位內膜，術中取囊腫壁為異位內膜。取同期因子宮肌瘤行子宮切除或子宮肌瘤挖除術患者的子宮內膜作為對照組（n=20）。所有患者年齡25～45歲，無其他內外科合并癥，術前3個月內未使用激素類藥物，所取標本均經病理學確診。取材過程嚴格遵守倫理學標準，均取得患者本人的知情同意。

1.2 實驗試劑Trizol購自生工生物工程（上海）股份有限公司，聚合酶鏈反應（PCR）引物由其合成；逆轉錄、SYBR Green Master Mix購自美國 Thermo公司；SDF-1多克隆抗體、CXCR4單克隆抗體和D2-40單克隆抗體購自美國Abcam公司；免疫組織化學（免疫組化）試劑盒、鼠抗人細胞角蛋白和波形蛋白購自北京中杉金橋生物技術有限公司；DMEM/F-12培養(yǎng)基、10%胎牛血清和Ⅳ型膠原酶購自美國Gibco公司；人SDF-1α購自美國PeproTech公司。

1.3 研究方法

1.3.1 實時定量PCR（RT-PCR）檢測SDF-1和CXCR4 mRNA表達水平 用Trizol抽提組織mRNA，分光光度計檢測RNA濃度。采用梯度PCR擴增儀逆轉錄合成cDNA，應用RT-PCR儀進行擴增。以β-actin為參照物，反應條件均按照試劑盒說明書執(zhí)行。所需引物見表1。

表1 RT-PCR所需引物序列

1.3.2 免疫組化法檢測SDF-1、CXCR4和D2-40蛋白表達水平 將所有標本用10%甲醛固定，石蠟包埋，4 μm厚連續(xù)切片并脫蠟，二甲苯、乙醇脫水，進行HE染色確認為子宮內膜組織。切片經枸櫞酸鹽緩沖液抗原修復后，操作步驟嚴格按照SP免疫組化試劑盒進行。磷酸鹽緩沖液（PBS）代替一抗作為陰性對照。鏡下觀察，以細胞膜和（或）細胞質呈清晰棕黃色或棕褐色顆粒為陽性表達。采用Image-J圖像分析系統(tǒng)對切片進行分析，計算SDF-1、CXCR4陽性細胞的積分光密度（integrated optical density，IOD）和總面積（area）。以平均光密度值（mean denisty，MD）作為 SDF-1、CXCR4 的表達強度，MD=IOD/area。D2-40陽性定位于淋巴管內皮細胞，呈黃褐色。每個D2-40染色陽性的內皮細胞、內皮細胞簇或單個微小脈管均計數為1個微淋巴管。MLVD判定方法[5]：先在低倍鏡下（×100）選取脈管數目最多的兩個區(qū)域，即“熱點”，然后在高倍鏡下（×200）觀察每個熱點中的5個視野，計數其中脈管數。最后計算2個熱點、5個視野的平均值作為該標本的MLVD。

1.3.3 異位子宮內膜間質細胞的分離和原代培養(yǎng) 細胞培養(yǎng)方法參照文獻[6]并加以改進。將所取內膜標本用PBS沖洗3次后剪碎，以0.125%膠原酶37℃消化30 min后于倒置顯微鏡下觀察到細胞脫落、游離后，將消化液吸出，經400目不銹鋼細胞濾網過濾至含10%胎牛血清的DMEM-F12培養(yǎng)基的離心管內終止消化。將未消化組織重復上述步驟2～3次。收集的細胞濾液以1 000 r/min離心5 min，棄上清液，沉淀用含10%胎牛血清的DMEM-F12培養(yǎng)液混懸后轉至培養(yǎng)瓶中，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。波形蛋白主要表達于基質細胞，細胞角蛋白表達于腺上皮細胞，選擇相應的抗體采用免疫組化法進行細胞鑒定。實驗所用基質細胞均為2～6代。

1.3.4 細胞劃痕實驗 將細胞按4×105/mL的密度接種于6孔板中，待細胞長滿后用100 μL吸頭在6孔板內垂直劃痕，用PBS清洗3次。對照組孔內加入DMEM-F12培養(yǎng)液，試驗組孔內加入等體積50 ng/mL SDF-1溶液，繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，在倒置光學顯微鏡下隨機取點觀察并拍照。采用Image-J圖像分析劃痕面積。細胞遷移率=（0 h劃痕面積－24 h劃痕面積）/0 h劃痕寬度×100%。

1.4 統(tǒng)計學方法采用SPSS 20.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計分析。定量資料用均數±標準差（±s）表示，異位內膜組和在位內膜組SDF-1、CXCR4 mRNA和蛋白質及MLVD比較采用配對t檢驗；異位內膜組或在位內膜組與正常內膜組的比較及細胞遷移率的組間比較采用兩獨立樣本均數的t檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 異位、在位及正常內膜中SDF-1、CXCR4 mRNA和蛋白的表達情況SDF-1、CXCR4 mRNA和蛋白在異位內膜中的表達水平高于在位內膜和正常內膜，在位內膜中的表達水平高于正常內膜，差異均有統(tǒng)計學意義（均 P＜0.01），見表1。SDF-1、CXCR4在子宮內膜基質細胞和腺體細胞中均有表達。3組內膜中，SDF-1在腺體細胞中的表達強度均高于基質細胞。CXCR4在異位內膜中主要表達于腺體細胞，而在位內膜和正常內膜基質細胞中CXCR4的表達強度高于腺體細胞。見圖1（見封三）。

表1 異位、在位及正常內膜中SDF-1、CXCR4 mRNA和蛋白的表達情況 （±s）

表1 異位、在位及正常內膜中SDF-1、CXCR4 mRNA和蛋白的表達情況 （±s）

組別 n SDF-1 CXCR4 mRNA 蛋白 mRNA 蛋白正常內膜組① 20 1.014±0.165 0.389±0..037 1.194±0.238 0.376±0.027在位內膜組② 20 2.148±0.179 0.445±0.031 1.739±0.295 0.409±0.042異位內膜組③ 20 4.318±0.236 0.509±0.043 2.889±0.347 0.477±0.031 t①vs.② 20.788 5.157 6.430 2.942 P 0.000 0.000 0.000 0.006 t①vs.③ 51.249 9.424 18.008 10.961 P 0.000 0.000 0.000 0.000 t②vs.③ 34.696 5.906 11.665 5.962 P 0.000 0.000 0.000 0.000

2.2 異位、在位及正常內膜中D2-40標記的MLVD比較D2-40陽性定位于淋巴管內皮細胞的細胞膜和細胞質。正常內膜中淋巴管管腔較大、形態(tài)完整，在位和異位內膜中淋巴管內皮細胞多不連續(xù)、管腔不完整、管壁?。ㄒ妶D1，見封三）。異位內膜、在位內膜和正常內膜中MLVD分別為（20.98±1.77）LV/mm2、（5.67 ±1.45）LV/mm2、（1.77 ±1.22）LV/mm2。異位內膜中MLVD高于在位和正常內膜，差異有統(tǒng)計學意義（n=20，t=34.912，P=0.000；t=39.970，P=0.000）。在位內膜中MLVD高于正常內膜，差異有統(tǒng)計學意義（n=20，t=9.179，P=0.000）。

2.3 異位內膜細胞鑒定結果異位內膜基質細胞細胞核較大，細胞膜表面有胞漿突起，邊界不清，呈紡錘狀。免疫組化結果示：細胞角蛋白陰性，波形蛋白陽性，其純度達95%以上。見圖2（見封三）。

2.4 細胞遷移實驗培養(yǎng)24 h后，DMEM-F12組劃痕面積大于SDF-1組（見圖3）。DMEM-F12組細胞遷移率為（36.06±2.92）%，SDF-1組細胞遷移率為（50.17±2.76）%，SDF-1組細胞遷移率高于 DMEMF12 組，差異有統(tǒng)計學意義（n=20，t=15.714，P=0.000）。見圖3（見封三）。

3 討論

EMs是一種常見的育齡期女性疾病，其發(fā)生機制尚不明確。SDF-1是CXC類趨化因子，由骨髓、子宮內膜等多種器官的基質細胞和內皮細胞產生，與其特異性受體CXCR4結合后激活下游信號通路，誘導靶細胞遷移和細胞骨架重排，廣泛參與多種生理、病理過程[7]。研究報道，卵巢癌、乳腺癌患者體內過度表達雌激素受體（ER），雌二醇（E2）可以刺激癌細胞中SDF-1分泌增加，并通過E2-SDF-1-CXCR4通路介導癌細胞的增殖，SDF-1作為雌激素的直接作用靶點，在疾病發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用[8]。EMs是雌激素依賴性疾病，因此本研究對SDF-1、CXCR4與EMs發(fā)病機制之間的關系進行了探究。

近年來，SDF-1、CXCR4與淋巴管生成、腫瘤淋巴轉移的關系逐漸成為研究熱點。研究指出，胰腺癌[2]、乳腺癌[3]患者的原發(fā)性腫瘤、癌旁組織、淋巴結中SDF-1表達水平逐漸升高，并且CXCR4表達水平越高，腫瘤原發(fā)部位的浸潤率越高；同時，存在淋巴轉移和TNM分期越高的患者新生淋巴管數目越多，提示SDF-1、CXCR4參與腫瘤的淋巴轉移，與患者的預后密切相關。EMs雖是良性疾病，但具有轉移性、侵襲性和高復發(fā)率等惡性生物學特征。在本研究中，采用RT-PCR和免疫組化法檢測正常、在位和異位內膜中SDF-1和CXCR4 mRNA和蛋白的表達水平，結果發(fā)現3組內膜中SDF-1 mRNA和蛋白的表達水平呈遞增趨勢，異位內膜中的表達水平顯著高于在位和正常內膜，在位內膜中的表達水平顯著高于正常內膜（P＜0.05）。有研究指出，子宮內膜基質細胞在雌激素刺激下可分泌SDF-1，并呈時間和濃度依賴性[9]。眾所周知，EMs是一種雌激素依賴性疾病，異位組織中雌激素代謝紊亂，其濃度是在位內膜的4～5倍[10-11]，因此在高雌激素作用下，SDF-1表達水平響應性地升高，該趨勢與本研究結果一致。鑒于以上研究結果，推測SDF-1、CXCR4表達異常參與了子宮內膜異位病灶的形成，在子宮內膜細胞的淋巴遷移中發(fā)揮一定作用。

D2-40是一種腎小球足突細胞膜表面的跨膜黏蛋白，既不能使有周細胞/平滑肌的大淋巴管顯色，也不與血管內皮反應，對新生淋巴管具有高度特異性[12]。D2-40標記陽性的淋巴管數目通常以MLVD表示。在腹膜型、深部浸潤型EMs中，異位病灶MLVD較相對應的正常組織均升高。本研究對卵巢型EMs異位組織進行研究，結果發(fā)現異位內膜中的MLVD顯著增高，高于在位和正常內膜（P＜0.05），在位內膜中MLVD約為正常內膜的3倍，進一步證實了淋巴系統(tǒng)在子宮內膜異位過程中扮演重要角色。Zhuo等[13]在小鼠體內注射SDF-1，發(fā)現小鼠體內新生淋巴管數目與SDF-1呈濃度相關性，說明SDF-1可直接促進淋巴管生成。同時SDF-1可利用相關通路誘導血管內皮生長因子 C（VEGF-C）分泌[14]，VEGF-C 與淋巴管內皮細胞上的膜型酪氨酸激酶受體VEGFR-3結合后，誘導淋巴管內皮細胞增殖，促進淋巴管生成[15]。因此，EMs中SDF-1、CXCR4表達升高可能促進淋巴管新生，為內膜細胞淋巴傳播提供了條件。

趨化因子作為趨化介質，其基本功能是吸引表達相應受體的靶細胞沿濃度梯度趨化性遷移。在本研究中，經SDF-1培養(yǎng)后的子宮內膜基質細胞的遷移率高于對照組（P＜0.05），表明SDF-1可以有效促進子宮內膜細胞的遷移。本研究觀察到在位內膜和異位內膜中新生淋巴管管壁薄，管腔不完整，呈擴張狀態(tài)，異位內膜中的淋巴管多位于囊腔面。這些形態(tài)特征有利于CXCR4陽性的子宮內膜基質細胞侵襲，內膜細胞進入新生淋巴管后沿SDF-1濃度梯度趨化性遷移，在SDF-1高表達的部位種植、生長，形成異位囊腫，完成淋巴途徑遷移。

綜上所述，EMs中SDF-1、CXCR4高表達，新生淋巴管數目增多，提示SDF-1、CXCR4可能與EMs淋巴管新生、內膜細胞淋巴遷移有一定關聯。EMs發(fā)病機制復雜，能否將降低SDF-1、CXCR4的表達、阻斷淋巴管生成作為治療該疾病新的切入點，仍需進一步的探究。