陳思凱，谷智越，鄭 萍，戴 毅，冷金花，郎景和

子宮內(nèi)膜異位癥（EMs）作為一種慢性疾病，發(fā)生率約在10%左右，其主要癥狀表現(xiàn)為痛經(jīng)、不孕、盆腔包塊及慢性盆腔痛，其中不孕患者高達25%～50%，可嚴重影響患者的生活質(zhì)量[1]。目前對于EMs的治療尚無根治的方法，主要的治療策略是通過手術(shù)治療和藥物的長期管理以達到解決疼痛癥狀、保留生育功能的目的[2]。因此，對于生育功能的保留是EMs治療的一項重要目標。EMs的發(fā)生和發(fā)展與多種免疫因子和免疫細胞的紊亂有關，而這些免疫因子和細胞的紊亂，例如白細胞介素（interleukine，IL）升高、巨噬細胞活化、前列腺素升高和氧化應激作用都與不孕相關[3]。但并非所有的EMs患者都有不孕的癥狀，因此關于EMs的不孕機制還需進一步研究。

自人類微生物組研究發(fā)起以來，越來越多的研究旨在探討微生物與人類宿主的關系，例如腸道微生物[4]、胎盤微生物[5]、口腔微生物[6]、泌尿系統(tǒng)微生物[7]和皮膚微生物[8]等，揭示了細菌與人類機體共生的機制。細菌擴增子16S核糖體RNA（16S-rRNA）測序技術(shù)的發(fā)展代替了傳統(tǒng)的微生物培養(yǎng)技術(shù)，可識別更多的豐度小并且難以培養(yǎng)的細菌，為人類更深入地進行微生物組學研究提供了更好的方法學。

女性陰道作為一個富含細菌群落的器官，主要是以乳酸桿菌為主導的細菌群落，其分泌的乳酸可維持陰道的弱酸性環(huán)境，以抵御外來細菌和病毒的侵襲[9-10]。有許多針對不孕患者的生殖道微生物研究都揭示了陰道內(nèi)細菌或者宮腔內(nèi)細菌的多樣性與不孕有關[11-12]，例如乳酸桿菌比例的增多對于生育結(jié)局有著積極的影響。但是目前大多數(shù)微生物組學的研究旨在針對總體不孕人群，而鮮有研究提及在EMs人群中不孕患者的微生物組學特點。本研究的目的旨在使用擴增子16S-rRNA測序技術(shù)對EMs合并不孕人群的微生物組學進行研究，通過生物信息學算法挖掘生物學標識，為今后診斷EMs不孕建立細菌篩查模型。此外，對于細菌組學的鑒別也可以從細菌代謝機制方面為今后EMs發(fā)病機制的研究做出一定鋪墊。

1 對象與方法

1.1 研究對象本研究為單中心微生物組學及生物信息學研究，于中國醫(yī)學科學院北京協(xié)和醫(yī)院婦產(chǎn)科進行，時間從2018年4月—2019年9月。經(jīng)門診檢查評估，入組患者符合EMs診斷并符合手術(shù)治療標準，研究者對于將要進行手術(shù)的住院患者及門診患者的陰道后穹窿微生物進行收集，對于符合入組標準的患者進行篩選，后續(xù)進行生物信息學分析。本研究共納入66例診斷為EMs的患者，其診斷結(jié)果由術(shù)后手術(shù)記錄及病理切片診斷或超聲檢查確認，包括卵巢型EMs 55例、深部浸潤型EMs 22例及淺表腹膜型EMs 12例，3種不同類型的EMs有重疊。其中EMs合并不孕的患者17例為不孕組，EMs不伴有不孕史的患者49例為對照組。本研究通過北京協(xié)和醫(yī)院倫理審查委員會批準（倫理審查號JS-1532）。擴增子16S-rRNA原始數(shù)據(jù)已上傳至美國國家生物技術(shù)信息中心（National Center of Biotechnology Information，NCBI）公共數(shù)據(jù)庫GenBank，數(shù)據(jù)編號MN663272-MN665377。

1.2 患者篩選納入標準：所有入組患者經(jīng)手術(shù)后病理檢查及手術(shù)記錄證實為EMs患者。①年齡＞18歲且＜45歲；②取樣當日前30 d未服用過抗生素；③2 d內(nèi)無性生活；④5 d內(nèi)無陰道沖洗或用藥等操作。排除標準：①細菌性陰道?。ㄍㄟ^患者自述癥狀及門診陰道分泌物核酸檢查排除）；②全身急性炎癥期；③惡性腫瘤患者；④自身免疫性疾病患者；⑤孕期；⑥月經(jīng)期；⑦宮內(nèi)放置節(jié)育環(huán)。

1.3 取樣方法選取病房次日將要行手術(shù)的患者或門診就診患者，于患者術(shù)前陰道沖洗前取樣。患者保持截石位，用一次性塑料擴陰器擴張陰道，暴露宮頸，使用臨床用陰拭子，于陰道后穹窿蘸取分泌物。取出陰拭子時應避免與陰道壁接觸污染，取出后將陰拭子置于冰盒，后于-80℃冰箱保存。

1.4 核糖體16S-RNA測序

1.4.1 DNA提取和聚合酶鏈反應（PCR）擴增 根據(jù)E.Z.N.A.soil試劑盒（OmegaBiotek,Norcross,GA,U.S.）說明書進行總DNA提取，DNA濃度和純度利用NanoDrop2000進行檢測，利用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA提取質(zhì)量；用338F和806R引物對V3V4可變區(qū)進行PCR擴增。

1.4.2 Illumina MiSeq測序 使用2%瓊脂糖凝膠回收PCR產(chǎn)物，利用AxyPrep DNA Gel Extraction Kit（Axygen Biosciences,Union City,CA,USA）進行純化，Tris鹽酸洗脫，2%瓊脂糖凝膠電泳檢測。利用QuantiFluorTMST（Promega，USA）進行檢測定量。根據(jù) Illumina MiSeq平臺（Illumina，San Diego，USA）標準操作規(guī)程將純化后的擴增片段構(gòu)建PE 2×300的文庫。

1.5 數(shù)據(jù)處理根據(jù)重疊堿基將兩端序列進行拼接，去除無法拼接的序列。根據(jù)100%的相似度對序列生成擴增子序列變異表（amplicon sequence variants，ASV）。經(jīng)過去除冗余數(shù)據(jù)和刪除嵌合子序列，最終生成受試分類單元表（operational taxonomy unit，OTU）。

1.6 統(tǒng)計學方法符合正態(tài)分布的定量資料用均數(shù)±標準差表示，組間比較采用t檢驗；不符合正態(tài)分布的定量資料用中位數(shù)和四分位數(shù)表示，組間比較采用秩和檢驗，Stata 12軟件進行計算，STAMP 2.1.3軟件制作柱狀圖。微生物組學alpha與beta多樣性采用R語言在Rstudio使用Linux平臺進行分析，使用R語言將數(shù)據(jù)制圖可視化。LeFSe分析使用在線分析平臺www.ehbio.com。主坐標分析（principle co-ordinate analysis，PCoA）是將不同組別間多種微生物菌落進行豐度比較所產(chǎn)生的一種高維度矩陣算法，并將多維度的數(shù)據(jù)以最大差異平面投影到二維平面。從Bray-Curtis矩陣和Unifrac矩陣算法對2組微生物組間差異進行比較算法，并且進行加權(quán)計算。線性判別式計算（linear discriminative analysis，LDA）與LeFSe（LDA effect size）是用來計算不同組間的生物學標識。學術(shù)界普遍采用LDA（log10）評分＞4為有生物學標識的潛能。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 2組一般資料比較2組年齡、身高和體質(zhì)量比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；不孕組痛經(jīng)程度（VAS評分）低于對照組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），見表1。

表1 2組一般資料比較

2.2 2組4種alpha多樣性與beta多樣性比較2組4種alpha多樣性指數(shù)比較差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），見圖 1。

從beta多樣性柱狀圖中可以看出，對于不孕組患者，無論是在科水平還是屬水平，乳酸桿菌的含量比對照組稍低；并且從平均豐度來看，乳酸桿菌仍是陰道后穹窿中占主導地位的細菌，見圖2（見封三）。不孕組與對照組間的微生物群落并未有明顯的分離，大部分為重疊面積，見圖3（見封三）。

普氏菌屬（Prevotella）、巨型球菌屬（Megasphere）和小類桿菌屬（Dialister）這3類細菌屬在不孕組的相對平均豐度較對照組升高，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），見圖4。對于陰道后穹窿的細菌群落的總體統(tǒng)計，選擇相對豐度大于0.01%并且可供數(shù)據(jù)庫參考識別的細菌，共有65個細菌屬，占主導地位的仍是乳酸桿菌屬，但不孕組的乳酸桿菌與對照組比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），見表2和圖4。

在不孕患者和對照組患者的LeFSe分析中，變形菌門（Proteobacteria）和 γ-變形菌綱（Gammaproteobacteria）的 LDA（log10）＞4，見圖 5。

3 討論

3.1 EMs、免疫與細菌的交聯(lián)關系EMs導致不孕的機制是多方面的，包括基因、解剖、內(nèi)分泌，甚至環(huán)境因素。EMs本身為一種炎癥性疾病，巨噬細胞等免疫細胞的異?；罨騃L等細胞因子的異常都與其發(fā)生有關，并且會影響受精卵的著床或精子和卵子的結(jié)合[3]。有研究對總體不孕患者的宮腔或陰道微生物群落進行了分析，發(fā)現(xiàn)一些有差異的細菌種類，例如脲原體（Ureaplasma）和加德納菌（Gardnerella）在不孕患者的子宮內(nèi)膜顯著增加[11]，并且在不孕患者中乳酸桿菌的含量明顯減少[12]。這與本研究的結(jié)果相似。乳酸桿菌作為一種主導陰道環(huán)境的細菌，其對于育齡期女性的生育功能有著十分重要的意義，但是其具體機制仍需要進一步研究，可能是因為乳酸桿菌產(chǎn)生的弱酸性環(huán)境和生物膜效應可在免疫學水平維持生殖道微環(huán)境的平衡[9]，從而保證受精卵著床時的免疫環(huán)境處在一個正常水平。

3.2 16S-rRNA測序方法學的不足之處本研究將陰道后穹窿作為一個取樣位點，而沒有將子宮內(nèi)膜作為取樣位點，其原因是目前學術(shù)界對于子宮內(nèi)膜是否有細菌尚有爭議。在測序技術(shù)發(fā)展以前，以細菌培養(yǎng)作為研究微生物作為主要手段的時代，普遍接受的觀點是子宮內(nèi)膜應為無菌的；但16S-rRNA測序技術(shù)發(fā)展后，許多研究都證實子宮內(nèi)膜[13]甚至胎盤[5]也存在定植菌群，并且對于一些疾病和胎兒生長都有著十分重要的關系[14]，但是這些研究并未闡明宮腔內(nèi)細菌到底是外來入侵還是正常定植[13]?！蹲匀弧冯s志最新的一項研究顯示，此前對于胎盤定植細菌的研究可能是由于測序方法不完善所導致的污染[15]，該觀點在學界引發(fā)了新的爭議。因此筆者認為，內(nèi)膜是否有菌應該分特殊情況，不能一概而論，一些生殖道的亞臨床感染可能并無癥狀，也較難以做出臨床診斷，但是這些感染可能也與EMs的發(fā)生、發(fā)展有著十分重要的關系[16-17]。此外，若能在將來以細菌組學特征作為診斷方法，后穹窿作為一個易于進行門診篩查的位點，可以用來進行快速無創(chuàng)的篩查。因此，本研究針對陰道后穹窿進行了微生物組學研究而并未將內(nèi)膜微生物納入研究范疇。

3.3 痛經(jīng)與生殖道微生態(tài)的關系本研究對于樣本人群特點的統(tǒng)計中，發(fā)現(xiàn)不孕患者的痛經(jīng)程度較對照組低（P＜0.05），其原因可能是本研究的樣本人群偏倚導致的。在納入研究的統(tǒng)計人群中大部分是通過手術(shù)確診的EMs，不孕患者手術(shù)的原因多為解決不孕的問題，而對照組患者手術(shù)的原因為EMs導致的疼痛或盆腔包塊，因此導致不孕患者痛經(jīng)程度較低的統(tǒng)計學結(jié)論。目前對于合并不孕的EMs患者痛經(jīng)程度尚無確切的研究，但有對于無痛經(jīng)的卵巢型EMs患者進行研究發(fā)現(xiàn)該類患者合并其他種類盆腔EMs的比例較高且臨床分期高[18]。在微生物水平的研究中，本研究得出的結(jié)論與已有研究結(jié)論大致相符[12]，即在不孕患者中乳酸桿菌的含量有所減少。在Ⅳ型陰道群落內(nèi)，巨型球菌屬或普氏菌屬等厭氧菌也可產(chǎn)生乳酸，表現(xiàn)出與乳酸桿菌類似的生理作用；但同時巨型球菌屬可能也會通過產(chǎn)生氨基酸等物質(zhì)促進細菌性陰道病相關細菌的生長，例如陰道加德納菌或厭氧消化鏈球菌（Peptostreptococcus anaerobius）[10]。因此，以上這些細菌含量的改變可能是由于潛在的炎癥作用導致宿主免疫系統(tǒng)紊亂，從而導致患者不孕的發(fā)生。其具體的機制還需進一步研究。

圖1 微生物組學群落特征4種alpha多樣性指數(shù)的分析

圖4 差異有統(tǒng)計學意義的微生物種類挖掘

表2 2組細菌屬平均菌群豐度比較 （%）

綜上，本研究對于EMs合并不孕和無不孕患者的陰道細菌群落進行了比較和生物學標識挖掘。2組患者的細菌群落在alpha多樣性中未見顯著差異，在beta多樣性中可觀察到不孕組的乳酸桿菌含量略有減少。在對于細菌相對豐度進行統(tǒng)計學計算方面，有3種細菌屬表現(xiàn)出了顯著的統(tǒng)計學差異，分別是普氏菌屬、巨型球菌屬和小類桿菌屬，它們在不孕組患者明顯升高。PCoA矩陣分析未表現(xiàn)出顯著的差異。門水平的變形菌門和綱水平的γ-變形菌綱可能是潛在的生物學標識物。糾正生殖道炎癥相關細菌的比例以及增加乳酸桿菌的含量有可能是未來改善EMs不孕的治療方法。此外，不同的細菌種類在不同個體差異較大，造成此差異的原因也是未來的研究重點。通過對EMs患者是否不孕的問題進行了微生物組學角度的分析，為今后EMs不孕的機制研究和微生物診斷學發(fā)展奠定了理論學基礎。

圖5 生物學標識的挖掘計算