劉雙雙 孫凱 蔡國(guó)棟 宋瑞龍 鄒輝 顧建紅 袁燕 劉學(xué)忠 劉宗平 卞建春

摘要：為探究脫氧雪腐鐮刀菌烯醇（deoxynivalenol，簡(jiǎn)稱DON）對(duì)離體T淋巴細(xì)胞活化的抑制作用，研究DON對(duì)刀豆蛋白A（concanavalin A，簡(jiǎn)稱Con A）介導(dǎo)的小鼠離體T淋巴細(xì)胞活化及活化標(biāo)志分子CD69、CD25、CD71的影響，以BALB/c小鼠T淋巴細(xì)胞為材料，分設(shè)細(xì)胞空白組、刀豆蛋白A對(duì)照組、不同濃度DON染毒組（Con A+0.5/1/2 μmol/L DON），用CCK-8法檢測(cè)24h內(nèi)細(xì)胞的相對(duì)活性，用流式細(xì)胞術(shù)分別檢測(cè)6、30、72 h時(shí)CD69、CD25、CD71的表達(dá)量。結(jié)果顯示，DON在終濃度為0.5、1、2 μmol/L時(shí)均極顯著地降低了Con A介導(dǎo)的T細(xì)胞的相對(duì)活性（P<0.01），在終濃度為2 μmol/L時(shí)顯著地降低了T細(xì)胞CD69的表達(dá)率（P<0.05），在終濃度為0.5、1、2 μmol/L時(shí)均極顯著地降低了CD25、CD71的表達(dá)率（P<0.01），且呈劑量效應(yīng)關(guān)系。由結(jié)果可知，脫氧雪腐鐮刀菌烯醇對(duì)動(dòng)物機(jī)體免疫抑制作用的產(chǎn)生與其直接抑制小鼠T淋巴細(xì)胞的活化有關(guān)。

關(guān)鍵詞：嘔吐毒素;脫氧雪腐鐮刀菌烯醇;刀豆蛋白;T淋巴細(xì)胞;CD69;CD25;CD71

中圖分類號(hào)： S852.4文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號(hào)：1002-1302（2020）04-0150-06

收稿日期：2019-01-15

基金項(xiàng)目：國(guó)家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃支持項(xiàng)目（編號(hào)：2016YFD0501208）;江蘇高校優(yōu)勢(shì)學(xué)科建設(shè)工程資助項(xiàng)目（PAPD）。

作者簡(jiǎn)介：劉雙雙（1996—），女，河南漯河人，碩士，主要從事動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)代謝病與中毒病研究。E-mail：1326247070@qq.com。

通信作者：卞建春，博士，教授，主要從事動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)代謝病與中毒病研究。Tel：（0514）87979042;E-mail：jcbian@yzu.edu.cn。

脫氧雪腐鐮刀菌烯醇（deoxynivalenol，簡(jiǎn)稱DON）又名嘔吐毒素（vomitoxin，簡(jiǎn)稱VT）[1-2]，是一種由粉紅鐮刀菌和禾谷鐮刀菌產(chǎn)生的單端孢霉烯族毒素，是廣泛引起糧食、飼料污染的主要霉菌毒素之一。1970年日本諸罔信一等首次從香川縣感染赤霉病的大麥中分離到DON。DON的細(xì)胞毒性很強(qiáng)，但無(wú)特殊的靶器官，對(duì)機(jī)體各種器官均有影響。不同動(dòng)物對(duì)DON的敏感程度表現(xiàn)不一，豬最敏感[3]。近年來(lái)，在我國(guó)動(dòng)物配合飼料中DON的檢出率高達(dá)98.02%，在豬飼料中最高含量達(dá)到4 773 μg/kg，遠(yuǎn)遠(yuǎn)超出我國(guó)限量標(biāo)準(zhǔn)（1 000 μg/kg），引起了養(yǎng)殖業(yè)的廣泛重視[4-5]。目前，國(guó)內(nèi)外對(duì)DON毒性的研究主要集中在動(dòng)物生產(chǎn)性能、器官組織病理?yè)p傷、免疫功能等方面[6]。大量研究證明，DON可對(duì)動(dòng)物機(jī)體的免疫系統(tǒng)產(chǎn)生明顯的急、慢性毒性作用。據(jù)報(bào)道，一次急性染毒DON可以導(dǎo)致小鼠肝、腎、脾、胸腺的細(xì)胞損傷，誘導(dǎo)和促進(jìn)免疫細(xì)胞的凋亡并抑制其增殖[7-8]。T淋巴細(xì)胞在細(xì)胞免疫中發(fā)揮主要作用，而其發(fā)揮作用的重要前提和基礎(chǔ)是T細(xì)胞必須經(jīng)過(guò)活化及增殖[9-10]。目前的研究表明，DON在體內(nèi)外均可抑制T淋巴細(xì)胞的活化與增殖[7，11]，但其作用機(jī)制尚未闡明。為了揭示DON抑制T淋巴細(xì)胞的活性與活化作用的機(jī)制，本研究分析了DON對(duì)離體T淋巴細(xì)胞活化過(guò)程的影響，并研究了DON對(duì)T細(xì)胞早期活化抗原CD69、中期活化抗原CD25和CD71表達(dá)的影響，本研究結(jié)果可以為DON中毒的防控提供理論依據(jù)。

1?材料與方法

1.1?材料

1.1.1?試驗(yàn)動(dòng)物?清潔級(jí)BALB/c小鼠，雄性，4～5周齡，體質(zhì)量（20±2） g，購(gòu)自揚(yáng)州大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

1.1.2?主要試劑與儀器?脫氧雪腐鐮刀菌烯醇、刀豆蛋白（concanavalin A，簡(jiǎn)稱Con A），購(gòu)自美國(guó)Sigma公司;CD3-APC、CD69-FITC、CD4-FITC、CD25-PE、CD71-PE流式抗體，購(gòu)自美國(guó)BD公司;RPMI-1640完全培養(yǎng)液，含10%胎牛血清（Gibco）、L-谷氨酰胺（2 mmol/L，Sigma）、二巰基乙醇（50 μmol/L，Sigma）、1%青鏈霉素（青霉素、鏈霉素比例為1 ∶1）、RPMI-1640培養(yǎng)基粉末（Gibco）;Cell Counting Kit-8，東仁化學(xué)科技有限公司;紅細(xì)胞裂解液，購(gòu)自索萊寶生物科技有限公司。

CyAn ADP7流式細(xì)胞儀，美國(guó)Beckman Couiter公司生產(chǎn);CO2培養(yǎng)箱，美國(guó)Thermo生產(chǎn);Tecan Sunrise光吸收酶標(biāo)儀，澳大利亞Tecan公司生產(chǎn);SW-CJ-1F型單人雙面凈化工作臺(tái)，蘇州凈化設(shè)備有限公司生產(chǎn);5810R臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)，德國(guó)Eppendorf公司生產(chǎn)。

1.2?試驗(yàn)方法

1.2.1?脾臟淋巴細(xì)胞懸液的制備?將BALB/c小鼠斷頸處死，無(wú)菌摘取脾臟，用組織研磨棒在200目濾網(wǎng)上研磨過(guò)濾，制備單細(xì)胞懸液。加入紅細(xì)胞裂解液處理3 min后，用無(wú)菌磷酸緩沖鹽溶液（PBS）洗滌細(xì)胞2次，1 000 r/min離心8 min。

將細(xì)胞按一定比例稀釋后重懸于1 mL 10%胎牛血清RPMI-1640完全培養(yǎng)液中，用臺(tái)盼藍(lán)染色計(jì)數(shù)活細(xì)胞數(shù)（活細(xì)胞數(shù)占總細(xì)胞數(shù)的95%以上），最終調(diào)整為細(xì)胞密度為3×106 mL的淋巴細(xì)胞懸液。

1.2.2?CCK-8法檢測(cè)DON對(duì)小鼠T淋巴細(xì)胞體外存活的影響?本試驗(yàn)分別設(shè)細(xì)胞空白組（Control組）、Con A對(duì)照組（終質(zhì)量濃度為5 mg/L，參照筆者所在實(shí)驗(yàn)室前期的研究成果[12]，下同）、Con A+0.5 μmol/L DON（終質(zhì)量濃度，下同）組、Con A+1 μmol/L DON組、Con A+2 μmol/L DON組，將制得的淋巴細(xì)胞懸液接種于12孔板中，每孔1 mL，于藥物處理組中加入相應(yīng)濃度的DON工作液各2 μL（終質(zhì)量濃度與各處理組對(duì)應(yīng)），除細(xì)胞空白組外，每組加入5 μL Con A（終濃度為5 mg/L）?；靹蛎靠字械呐囵B(yǎng)液，分組加入96孔板中，每組設(shè)6個(gè)重復(fù)，100 μL/孔，同時(shí)設(shè)立空白對(duì)照孔（不加細(xì)胞），之后在37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24 h。加入CCK-8試劑，10 μL/孔，于37 ℃、CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3 h后，立刻用酶標(biāo)儀在450 nm處測(cè)定吸光度。根據(jù)公式[細(xì)胞相對(duì)存活率=（處理組吸光度-空白對(duì)照組吸光度）/（Con A組吸光度-空白對(duì)照組吸光度）]計(jì)算細(xì)胞相對(duì)存活率。具體公式如下：

細(xì)胞存活率=[（D450 nm（s）-D450 nm（b））/（D450 nm（c）-D450 nm（b））]×100%;

抑制率=[（D450 nm（c）-D450 nm（s））/（D450 nm（c）-D450 nm（b））]×100%。

式中：s表示試驗(yàn)孔;c表示對(duì)照孔;b表示空白孔。

1.2.3?T細(xì)胞CD69、CD25、CD71表達(dá)的檢測(cè)?采用直接免疫熒光標(biāo)記法染色，細(xì)胞培養(yǎng)6 h后，取樣離心，用冷PBS清洗2次后，將細(xì)胞懸液濃縮至100 μL，分別加入1 μg CD3-APC、CD69-FITC單克隆抗體;細(xì)胞培養(yǎng)30 h后，分別加入1 μg CD25-PE、CD4-FITC單克隆抗體;細(xì)胞培養(yǎng)72 h后，分別加入1 μg CD71-PE、CD3-APC單克隆抗體，4 ℃避光孵育30 min，用冷PBS離心洗滌1次，重懸于500 μL PBS中，立即上流式細(xì)胞儀（FACSCalibur）檢測(cè)。

1.2.4?統(tǒng)計(jì)學(xué)分析?所有數(shù)據(jù)以均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，用SPSS 22.0軟件進(jìn)行單因素方差分析，組間比較采用配對(duì)t檢驗(yàn)，以P<0.05、P<0.01作為差異顯著性判斷標(biāo)準(zhǔn)。

2?結(jié)果與分析

2.1?DON對(duì)小鼠T淋巴細(xì)胞相對(duì)活性的影響

小鼠T淋巴細(xì)胞培養(yǎng)24 h后，用酶標(biāo)儀在450 nm 處測(cè)定吸光度，以此來(lái)計(jì)算細(xì)胞的相對(duì)活性。由圖1可見(jiàn)，加入Con A后，與細(xì)胞空白組對(duì)比，細(xì)胞的相對(duì)活性極顯著提高（P<0.01）;加入DON后，各染毒組細(xì)胞活性均降低，與Con A比較均存在極顯著差異（P<0.01）。

2.2?DON對(duì)小鼠T淋巴細(xì)胞CD69表達(dá)的影響

小鼠T淋巴細(xì)胞培養(yǎng)6 h后，用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)T淋巴細(xì)胞早期活化抗原CD69的表達(dá)情況。如圖2所示，細(xì)胞空白組小鼠CD3+T細(xì)胞中CD69+T細(xì)胞的比例為（9.04±6.24）%，即CD69的表達(dá)率為（9.04±6.24）%。在用Con A刺激6 h后，其CD69表達(dá)量達(dá)到（35.88±7.20）%，與空白組相比極顯著升高（P<0.01）。加入DON后，隨著DON終濃度的升高，Con A介導(dǎo)的T細(xì)胞CD69表達(dá)呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，并具有劑量-效應(yīng)關(guān)系，2 μmol/L DON組與Con A組相比差異顯著（P<0.05）。

2.3?DON對(duì)小鼠T淋巴細(xì)胞CD25表達(dá)的影響

小鼠T淋巴細(xì)胞培養(yǎng)30 h后，用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)調(diào)節(jié)T淋巴細(xì)胞中期活化抗原CD25的表達(dá)。由圖3可以看出，細(xì)胞空白組小鼠CD4+T細(xì)胞中CD25+T細(xì)胞的比例為（9.88±2.57）%，即CD25的表達(dá)率為（9.88±2.57）%。在用Con A刺激30 h 后，其CD25表達(dá)量達(dá)到（50.64±6.54）%，與空白組相比極顯著升高（P<0.01）。加入DON后，隨著DON終濃度的升高，Con A介導(dǎo)的T細(xì)胞CD25表達(dá)呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，并具有劑量-效應(yīng)關(guān)系，各染毒組與Con A組相比均有極顯著差異（P<0.01）。

2.4?DON對(duì)小鼠T淋巴細(xì)胞CD71表達(dá)的影響

小鼠T淋巴細(xì)胞培養(yǎng)72 h后，用雙抗體染色法結(jié)合流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)調(diào)節(jié)T淋巴細(xì)胞中期活化抗原CD71的表達(dá)。由圖4可以看出，細(xì)胞空白組小鼠CD3+T細(xì)胞中CD71+T細(xì)胞的比例為（2.88±2.57）%，即CD71表達(dá)率為（2.88±2.57）%。在用Con A刺激72 h后，其CD71表達(dá)量達(dá)到（35.81±6.54）%，與空白組相比極顯著升高（P<0.01）。加入DON后，隨著DON終濃度的升高?Con A介導(dǎo)的

T細(xì)胞CD71的表達(dá)量呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，并具有劑量-效應(yīng)關(guān)系，各染毒組與Con A組相比均有極顯著差異（P<0.01）。

3?討論

DON對(duì)谷物的污染狀況相當(dāng)普遍，其對(duì)動(dòng)物機(jī)體免疫功能的影響已經(jīng)引起醫(yī)學(xué)界的廣泛重視。DON在高濃度時(shí)可誘導(dǎo)免疫細(xì)胞凋亡，從而引發(fā)免疫抑制;在低濃度時(shí)可抑制免疫細(xì)胞增殖和細(xì)胞因子的分泌，擾亂免疫系統(tǒng)的正常功能[13]。DON也可通過(guò)對(duì)淋巴結(jié)和脾臟中免疫細(xì)胞數(shù)量和功能的調(diào)節(jié)，引起小鼠淋巴細(xì)胞免疫球蛋白A（IgA）分泌量升高[14]。Kim等報(bào)道，DON可導(dǎo)致雄性小鼠體內(nèi)IgM、IgG的含量明顯降低[15]。Ouyang等研究發(fā)現(xiàn)，DON能延遲或抑制體外培養(yǎng)CD4+T淋巴細(xì)胞的增殖[11]?？傊?，DON可以通過(guò)誘導(dǎo)免疫細(xì)胞凋亡、抑制其增殖而影響免疫細(xì)胞因子的分泌及抗體的表達(dá)，進(jìn)而對(duì)細(xì)胞免疫和體液免疫產(chǎn)生影響。淋巴細(xì)胞是動(dòng)物機(jī)體進(jìn)行免疫調(diào)節(jié)的核心成分，其中T淋巴細(xì)胞是淋巴細(xì)胞中數(shù)量最多、功能最復(fù)雜的一類。它具有多種生物學(xué)功能，如直接殺傷靶細(xì)胞、輔助或抑制B細(xì)胞產(chǎn)生抗體、對(duì)特異性抗原或促有絲分裂原的應(yīng)答反應(yīng)以及產(chǎn)生細(xì)胞因子等，此外，T淋巴細(xì)胞對(duì)機(jī)體抵御疾病也發(fā)揮著非常重要的作用[16]。目前，在關(guān)于DON免疫毒性機(jī)制的相關(guān)研究中，雖已有報(bào)道表明，DON可以抑制T淋巴細(xì)胞的增殖，但其作用機(jī)制尚不明確。T淋巴細(xì)胞的活化是其發(fā)揮免疫功能的重要前提和基礎(chǔ)[9]。本試

驗(yàn)在證明了DON對(duì)小鼠活化過(guò)程中的T淋巴細(xì)胞相對(duì)有明顯的抑制作用的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步探究了DON對(duì)T細(xì)胞活化抗原表達(dá)的影響。

Con A是T細(xì)胞多克隆刺激劑，可以作用于T細(xì)胞表面的T細(xì)胞抗原受體（TCR）-CD3復(fù)合體，從而刺激T細(xì)胞活化及增殖反應(yīng)[17]。T細(xì)胞活化后可誘發(fā)靜止細(xì)胞分泌淋巴因子IL-4、γ-IFN等，同時(shí)表達(dá)一系列新的表面分子（如高親和力CD69和CD25）等[18-20]，這些分子被稱為表面活化標(biāo)志。CD69是一種Ⅱ型跨膜糖蛋白，是活化的T細(xì)胞表面最早表達(dá)的分子。靜止?fàn)顟B(tài)下的T細(xì)胞一般不表達(dá)CD69，在活化后1～2 h即可以檢測(cè)到CD69的表達(dá)[21]，它可以作為細(xì)胞共刺激信號(hào)進(jìn)一步增強(qiáng)細(xì)胞的活化或增殖分化，可介導(dǎo)細(xì)胞激活后細(xì)胞因子的合成[22]，因此CD69可作為T(mén)細(xì)胞早期活化的標(biāo)志。本研究發(fā)現(xiàn)，DON可抑制Con A介導(dǎo)的T淋巴細(xì)胞CD69的表達(dá)，說(shuō)明DON可通過(guò)抑制CD69的表達(dá)來(lái)降低細(xì)胞前期活化的效應(yīng)。CD25是IL-2（白介素2）受體的α鏈，分子量為55 ku，主要在CD4+T細(xì)胞上表達(dá)[23]。IL-2受體能否表達(dá)主要取決于T細(xì)胞對(duì)IL-2的應(yīng)答，極少部分靜止的T細(xì)胞會(huì)表達(dá)IL-2受體，而活化的T細(xì)胞表達(dá)量明顯上升，因?yàn)門(mén)細(xì)胞通過(guò)抗原提呈細(xì)胞（APC）遞呈的抗原產(chǎn)生活性后，能使T細(xì)胞膜表面表達(dá)CD25即IL-2R，并分泌產(chǎn)生大量IL-2。因此可見(jiàn)，CD25可反映活化T細(xì)胞的增殖，被認(rèn)為是激活T淋巴細(xì)胞的標(biāo)志[24]。本研究發(fā)現(xiàn)，DON可抑制Con A介導(dǎo)的T淋巴細(xì)胞CD25的表達(dá)，并可能因此抑制T細(xì)胞對(duì)IL-2的應(yīng)答，從而影響免疫功能。CD71是轉(zhuǎn)鐵蛋白受體（TfR），表達(dá)于活化的白細(xì)胞，分子量約為95 ku，是細(xì)胞生長(zhǎng)和吸收鐵所必需的蛋白。TfR是一種Ⅱ型跨膜糖蛋白，是由2個(gè)同源二聚體（180 ku）的亞基通過(guò)2條二硫鍵交聯(lián)而成的。TfR的表達(dá)量主要是根據(jù)細(xì)胞內(nèi)的鐵水平進(jìn)行轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)的[25]，所有正常細(xì)胞都能低水平表達(dá)CD71，但處于高增殖狀態(tài)的細(xì)胞表達(dá)水平會(huì)明顯升高。CD71不僅僅參與鐵的吸收，在細(xì)胞的生長(zhǎng)、增殖中發(fā)揮作用，同時(shí)具有免疫調(diào)節(jié)功能，可以提供激活T細(xì)胞所必需的第二刺激信號(hào)，這也表明CD71是正常T細(xì)胞成熟所必需的。本研究發(fā)現(xiàn)，DON可以抑制Con A介導(dǎo)的T淋巴細(xì)胞CD71的表達(dá)，影響了細(xì)胞的生長(zhǎng)、增殖和免疫調(diào)節(jié)功能的發(fā)揮。本研究還發(fā)現(xiàn)，DON可通過(guò)抑制T淋巴細(xì)胞的活化及表面活化標(biāo)志分子的表達(dá)，影響動(dòng)物機(jī)體細(xì)胞免疫的調(diào)節(jié)功能，從而引起免疫抑制的發(fā)生。

4?結(jié)論

DON可直接抑制Con A介導(dǎo)的小鼠T淋巴細(xì)胞體外活化，并且能夠抑制早期活化標(biāo)志CD69及中期活化標(biāo)志CD25、CD71的表達(dá)。這一結(jié)果表明DON對(duì)動(dòng)物免疫系統(tǒng)的抑制作用與其可直接抑制T淋巴細(xì)胞的活性與活化作用有關(guān)。

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