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捏法對(duì)大鼠至陽(yáng)穴皮膚內(nèi)源性大麻素受體的影響

2020-04-15 11:33吳倩雯余文英黃明愉林麗莉
福建中醫(yī)藥 2020年2期
關(guān)鍵詞:內(nèi)源性大麻試劑盒

吳倩雯,余文英,黃 華,黃明愉,林麗莉

(福建中醫(yī)藥大學(xué)針灸學(xué)院,福建 福州350122)

捏法是以捏、捻、提等復(fù)合式手法為主,將脊骨處皮膚提起捻動(dòng)的操作手法,源于捏脊手法,是一種對(duì)局部皮膚的機(jī)械力刺激。 內(nèi)源性大麻素系統(tǒng)(endogenous cannabinoid system,ECS)由大麻素受體、內(nèi)源性大麻素及其合成和降解的酶組成[1],在表皮、毛囊、皮脂腺、皮肌層均有分布[2-3],參與調(diào)節(jié)皮膚免疫[4]、炎性反應(yīng)及損傷修復(fù)[2-3],其中,大麻素受體主要包括內(nèi)源性大麻素受體1(CB1)和內(nèi)源性大麻素受體2(CB2)[1]。 研究表明:皮膚中的CB1 和CB2 可 能 參 與 抗 炎[5]及 皮 膚 損 傷 修 復(fù)[2],CB2 還 與鎮(zhèn)痛效應(yīng)有關(guān),阻斷CB2 可使電針鎮(zhèn)痛效應(yīng)減弱[6]。有人以系統(tǒng)評(píng)價(jià)的方法發(fā)現(xiàn)按摩能夠激活ECS[7]。捏法作為一種按摩手法,對(duì)于ECS 的影響尚不明確,因此,我們采用蛋白免疫印跡(Western blot)檢測(cè)方法,觀察不同強(qiáng)度的捏法刺激對(duì)CB1 和CB2 的影響。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF 級(jí)雄性SD 大鼠24 只由福建中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供,6~7 周齡,體質(zhì)量(200±20) g,許可證號(hào):SCXK(滬)2012-0002。 實(shí)驗(yàn)環(huán)境符合國(guó)家實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飼養(yǎng)和使用指南,室溫保持在(22±2)℃,光/暗周期為12/12 h,動(dòng)物自由取食和飲水。

1.2 主要試劑和儀器 RIPA 裂解液(強(qiáng))、PMSF、BCA 定量試劑盒、超敏ECL 化學(xué)發(fā)光試劑盒(上海碧云天生物技術(shù)有限公司);CB1 一抗、β-actin 一抗(武漢三鷹有限公司);CB2 一抗(武漢澳波泰克生物科技有限公司);HRP 鼠抗兔IGg 二抗(南京諾維贊生物科技有限公司);Stripping Buffer 洗脫液、ST 16R 高速冷凍離心機(jī)(美國(guó)Thermo 公司);Infinite M200 PRO 全自動(dòng)酶標(biāo)儀(瑞士TECAN 公司);ChemiDoc XRS+化學(xué)發(fā)光成像分析系統(tǒng)(美國(guó)Bio-Rad 公司)。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 分組 24 只大鼠編號(hào)后按照隨機(jī)數(shù)字表分為空白組、輕刺激組、中刺激組、重刺激組,每組各6 只。

2.2 干預(yù)方法 適應(yīng)性喂養(yǎng)1 周后,空白組大鼠僅模擬抓取動(dòng)作,不做任何治療;輕、中、重刺激組于至陽(yáng)穴分別給予捏法7、14、21 次,每天1 次,每周刺激5 d,休息2 d,連續(xù)3 周。 至陽(yáng)穴位于背中線第7、第8 胸椎棘突間,參照于曙光主編《實(shí)驗(yàn)針灸學(xué)》[8]附錄圖選取。 捏法的具體操作:以左手固定大鼠及局部棘突,右手拇指伸直,以拇指與食指、中指螺紋面將皮膚捏起, 力度以大鼠不尖叫為度, 約2下/s 的頻率進(jìn)行捏捻。 捏脊由同一人操作,實(shí)驗(yàn)前進(jìn)行手法培訓(xùn),嚴(yán)格按照要求操作。

2.3 至陽(yáng)穴皮膚取材 干預(yù)3 周后取材。 各組大鼠麻醉后,局部脫毛,取各組大鼠至陽(yáng)穴部位包含真皮乳頭層、真皮網(wǎng)織層、皮下組織層的皮膚,體積約0.7 cm×0.7 cm×0.5 cm,液氮速凍,-80 ℃冰箱保存。

2.4 皮膚內(nèi)源性大麻素受體含量檢測(cè) 取樣后液氮下研磨,以組織(g)∶裂解液(μL)=1∶50 的比例加入組織裂解液,冰上超聲研磨后,4℃,14 000 r/min離心15 min,取上清液,BCA 法定量。 進(jìn)行Western blot 檢測(cè): ①取13 μL 定量后樣品, 用10% SDSPAGE 凝膠電泳分離后,半干轉(zhuǎn)至PVDF 膜。 ②轉(zhuǎn)膜后將PVDF 膜用脫脂奶粉室溫下封閉2 h,TBST洗滌8 min;放入一抗中4 ℃搖床過(guò)夜后,TBST 洗滌3 次,每次5 min;放入二抗中常溫1 h,TBST 洗滌3 次后顯影;以β-actin 為內(nèi)參,顯影后Stripping Buffer 洗脫液洗脫后重新封閉,加入β-actin 一抗,重復(fù)上述流程。③超敏ECL 化學(xué)發(fā)光試劑盒顯影,按照試劑盒說(shuō)明書配置顯影液, 采用ChemiDoc XRS+化學(xué)發(fā)光成像分析系統(tǒng)進(jìn)行圖像采集及處理,通過(guò)光密度計(jì)算指標(biāo)與內(nèi)參的體積比值,即為蛋白相對(duì)表達(dá)量。

2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 22.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。 計(jì)量資料符合正態(tài)分布的以(±s)表示,兩兩比較采用t 檢驗(yàn),多組間比較采用單因素方差分析。

3 結(jié) 果

4 組至陽(yáng)穴皮膚CB1、CB2 蛋白相對(duì)表達(dá)量見(jiàn)圖1、圖2 及表1。

圖1 4 組至陽(yáng)穴皮膚CB1 蛋白相對(duì)表達(dá)量

圖2 4 組至陽(yáng)穴皮膚CB2 蛋白相對(duì)表達(dá)量

表1 4 組至陽(yáng)穴皮膚CB1、CB2 蛋白相對(duì)表達(dá)量(±s)

表1 4 組至陽(yáng)穴皮膚CB1、CB2 蛋白相對(duì)表達(dá)量(±s)

注:與空白組比較,1) P<0.01,2) P<0.05;與重刺激組比較,3) P<0.01。

CB2 0.33±0.13 0.64±0.232)0.67±0.182)0.56±0.15組別空 白 組輕刺激組中刺激組重刺激組n 6 6 6 6 CB1 0.53±0.09 0.49±0.143)0.53±0.093)0.78±0.121)

4 討 論

捏脊常用于兒童保健,具有提高免疫力、促進(jìn)生長(zhǎng)發(fā)育的作用。 有研究者認(rèn)為諸多傳統(tǒng)體表刺激如針灸、整脊、按摩等方法對(duì)神經(jīng)發(fā)育及神經(jīng)保護(hù)作用的效應(yīng),很有可能是依賴內(nèi)源性大麻素系統(tǒng)介導(dǎo)實(shí)現(xiàn)的[9]。 本實(shí)驗(yàn)中,在予以3 周的捏法后,大鼠皮膚內(nèi)源性大麻素受體表達(dá)發(fā)生了改變。 皮膚是人體最大的免疫器官,在許多人和鼠的細(xì)胞群如皮膚神經(jīng)纖維、肥大細(xì)胞、表皮角質(zhì)形成細(xì)胞和附屬組織細(xì)胞中,可觀察到CB1 和CB2 的免疫反應(yīng)[4],手法及針刺治療都能夠?qū)ζ洚a(chǎn)生影響[9-10]。 捏法作為一種治療手法,能夠?qū)ζつw產(chǎn)生機(jī)械力刺激。 通過(guò)對(duì)至陽(yáng)穴大麻素受體蛋白表達(dá)的檢測(cè)發(fā)現(xiàn):不同刺激量的捏法對(duì)于內(nèi)源性大麻素系統(tǒng)的效應(yīng)是不同的,且以中刺激和重刺激效果更為顯著,說(shuō)明這種體表刺激的方式需要達(dá)到一定刺激量才能夠發(fā)揮作用。

但激活不同受體所需的刺激量有所不同。 由于分布的不同,CB1 與突觸可塑性更為相關(guān),CB2 與免疫反應(yīng)更有關(guān)聯(lián),因此不同強(qiáng)度的手法刺激影響的效應(yīng)有所不同。 CB2 功能的發(fā)揮更大程度上受外部刺激的影響[11],較輕的捏法刺激就能對(duì)其產(chǎn)生影響。 至者,達(dá)也,又極也;陽(yáng)中之陽(yáng),陽(yáng)之至也曰“至陽(yáng)”,至陽(yáng)穴位于背部陰陽(yáng)交關(guān)處[12]。刺激至陽(yáng)穴能夠使CB2 表達(dá)增多而調(diào)動(dòng)ECS 系統(tǒng), 影響人體免疫反應(yīng)。 皮膚中表皮、毛囊、皮脂腺、皮肌層是兩種受體共同存在的區(qū)域,不同的是,CB2 在血管平滑肌、神經(jīng)纖維外膜及神經(jīng)纖維束束膜也有分布[3],因此,CB2 激活所需的刺激強(qiáng)度較小或許與其更廣泛的分布有關(guān)。 其次,外周內(nèi)源性大麻素參與抗痛覺(jué)過(guò)敏,其作用主要通過(guò)CB1 來(lái)實(shí)現(xiàn)[13],重刺激引起的CB1 表達(dá)增多可能與疼痛有關(guān)。重刺激干預(yù)下,CB1表達(dá)增多,CB2 增多不顯著,這或許是由于此時(shí)內(nèi)源性大麻素系統(tǒng)的作用更傾向于抗疼痛。 捏脊手法臨床上既應(yīng)用于保健,也應(yīng)用于治療,在腦癱患兒的治療中亦有應(yīng)用。 若僅為了提高免疫力,手法刺激應(yīng)更加輕柔;若為了治療腦癱等疾病,則應(yīng)采用相對(duì)更強(qiáng)的刺激,這與臨床實(shí)際是相符合的。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:①一定刺激量的捏法刺激能夠激活ECS 系統(tǒng),從而增強(qiáng)皮膚的抗炎與修復(fù)能力,這或許是捏脊手法起效的可能機(jī)制之一;②重刺激強(qiáng)度的捏法能夠使至陽(yáng)穴皮膚CB1 表達(dá)增多,輕刺激與中刺激強(qiáng)度的捏法能夠使至陽(yáng)穴皮膚CB2 表達(dá)增多,一定強(qiáng)度的捏法刺激可能提高皮膚修復(fù)及抗炎能力。

本實(shí)驗(yàn)僅采用普通大鼠進(jìn)行實(shí)驗(yàn),尚未引入病理模型,選穴和手法也比較單一。 手法治療如何通過(guò)ECS 系統(tǒng)對(duì)疾病產(chǎn)生作用,仍需要進(jìn)一步研究。

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