葛夢(mèng)蝶，代安然，楊崇婧，劉京京，CHEUNG Chi Keung Peter ，陳磊*

1(江南大學(xué) 生物工程學(xué)院，糖化學(xué)與生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 無(wú)錫，214122)2(香港中文大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，中國(guó) 香港，999077)

虎奶菇(Pleurotustuber-regium, PTR)是食藥兩用擔(dān)子菌，富含蛋白、多糖等營(yíng)養(yǎng)成分及多種活性物質(zhì)，常被用來(lái)治療頭痛、胃痛、發(fā)燒以及哮喘、天花和高血壓[1-2]等多種疾病。研究表明，從PTR菌核和菌絲體中提取的非淀粉多糖和多糖-蛋白復(fù)合物除了具有多種營(yíng)養(yǎng)價(jià)值外，還具有免疫調(diào)節(jié)和癌細(xì)胞殺傷作用[3-4]。這些活性成分主要存在于PTR的細(xì)胞壁中，在前期研究中，通過(guò)對(duì)PTR 菌核細(xì)胞壁可溶性多糖的分離和鑒定，初步闡明了菌核細(xì)胞壁的骨架結(jié)構(gòu)[5]，即超支化β-葡聚糖，這類(lèi)多糖因特殊的超支化結(jié)構(gòu)和準(zhǔn)球狀空間形態(tài)而具有良好的可溶性、高分散性及大量可用于改性的末端基團(tuán)，因而在高分子材料、生物醫(yī)學(xué)以及緩釋材料等領(lǐng)域具有巨大的應(yīng)用潛力[6]。

虎奶菇的生長(zhǎng)周期主要包括菌絲體、菌核和子實(shí)體3個(gè)階段，菌核作為PTR的特殊生長(zhǎng)階段，生長(zhǎng)條件較為苛刻，獲取不易，因此這類(lèi)超支化多糖的研究和應(yīng)用也受到了極大限制。作為虎奶菇生長(zhǎng)初始階段的菌絲體，更易于通過(guò)發(fā)酵等手段獲取，但其細(xì)胞壁(Pleurotustuber-regiummycelium cell wall, PTR-MCW)的結(jié)構(gòu)信息尚不清楚，價(jià)值還亟待開(kāi)發(fā)。因此，有必要對(duì)PTR-MCW的組成和結(jié)構(gòu)進(jìn)行研究，為進(jìn)一步開(kāi)發(fā)虎奶菇高附加值產(chǎn)品提供理論依據(jù)。本文通過(guò)不同提取方式對(duì)PTR-MCW成分進(jìn)行分離及成分分析，并對(duì)主要可溶性細(xì)胞壁多糖進(jìn)行結(jié)構(gòu)表征，為進(jìn)一步開(kāi)發(fā)虎奶菇資源打下堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)菌種及培養(yǎng)基

PTR，購(gòu)于美國(guó)Fungi Perfecti有限公司；馬鈴薯-葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(PDA)，北京陸橋技術(shù)股份有限公司。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)試劑

酵母浸粉，安琪酵母股份有限公司；BCA法蛋白濃度測(cè)定試劑盒(增強(qiáng)版)，碧云天生物技術(shù)有限公司；單糖標(biāo)品(98%阿拉伯糖、99%巖藻糖、99%半乳糖、98%葡萄糖胺、色譜純葡萄糖、99%甘露糖、98%鼠李糖、98%木糖)、99.7%二甲基亞砜、99%肌醇、99.9%二氯甲烷，百靈威科技有限公司；99.5%碘甲烷，梯希愛(ài)化成工業(yè)發(fā)展有限公司；色譜純甲醇，瑞典歐森巴克化學(xué)公司；苯甲基磺酰氟(phenymethylsulfonyl fluuoried，PMSF)，上海麥克林生化科技有限公司；其他試劑，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.1.3 儀器與設(shè)備

HH·B11·360型電熱恒溫培養(yǎng)箱，連云港醫(yī)療器械設(shè)備廠(chǎng)；7GI-16M型臺(tái)式離心機(jī)，湖南湘儀實(shí)驗(yàn)儀器開(kāi)發(fā)有限公司；HYG-A型全溫?fù)u床柜，太倉(cāng)市實(shí)驗(yàn)設(shè)備廠(chǎng)；FA-1004型電子天平，上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司；SW-CJ-IF型超凈工作臺(tái)，蘇州凈化設(shè)備有限公司；RE 52-3型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器，上海滬西分析儀器廠(chǎng)；Enspire 2300型多標(biāo)記檢測(cè)系統(tǒng)(酶標(biāo)儀)，美國(guó)珀金埃爾默有限公司；CRX3HD型冷凍干燥機(jī)，日本日立公司；NDK200-2型氮吹儀，杭州米歐儀器有限公司；EASY-LOAD型Pall minimate切向流超濾系統(tǒng)，頗爾公司；TSQ 8000型三重四級(jí)桿氣質(zhì)聯(lián)用，美國(guó)賽默飛世爾科技有限公司；DAWN HELEOS Ⅱ型多角度激光光散射凝膠色譜系統(tǒng)(SEC-MALLS)，美國(guó)懷雅特技術(shù)公司；NEXUS型傅里葉變換紅外光譜儀(FT-IR)，美國(guó)尼高力儀器公司；SU8220型冷場(chǎng)發(fā)射掃描電子顯微鏡(SEM)、H-7650型透射電子顯微鏡(TEM)，日本日立公司。

色譜柱填料及裝柱參數(shù)為Sephacryl S-1000(90 cm×2.6 cm i.d.)，Sephacryl S-400(90 cm×2.6 cm i.d.)，Sephacryl S-200(70 cm×2.6 cm i.d.)，Sephadex G10(70 cm×2.6 cm i.d.)，英國(guó)安發(fā)瑪西亞生物技術(shù)公司，填料為GE-HealthCare。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 PTR菌絲體的發(fā)酵與細(xì)胞壁制備

虎奶菇接種于PDA平板上，30 ℃培養(yǎng)7 d，4 ℃保藏，定期進(jìn)行轉(zhuǎn)接。

從長(zhǎng)滿(mǎn)虎奶菇菌絲的PDA平板上切下10片約1 cm2的小塊，加入到裝有200 mL種子培養(yǎng)基的500 mL三角瓶中，于30 ℃、180 r/min條件下?lián)u床培養(yǎng)3 d，制備種子液。將發(fā)酵好的種子液以5%的接種量轉(zhuǎn)接到裝有190 mL發(fā)酵液的500 mL的三角瓶中，30 ℃、180 r/min條件下?lián)u瓶培養(yǎng)6 d。種子培養(yǎng)基與發(fā)酵培養(yǎng)基配方均為(g/L)：葡萄糖30、酵母浸粉4、KH2PO41、MgSO4·7H2O 0.6，pH自然。

發(fā)酵完成后，取發(fā)酵液用尼龍紗布過(guò)濾分離，并用去離子水洗滌菌絲體，至洗液為無(wú)色，抽濾去除多余的水分后，-80 ℃冷凍過(guò)夜并真空冷凍干燥。取適量?jī)龈珊蟮木z體，粉碎過(guò)35目篩(0.5 mm)。粉碎后的PTR菌絲體分別先后用A液(1 mmol/L PMSF)、B液(50 g/L NaCl，1 mmol/L PMSF)、C液(20 g/L NaCl，1 mmol/L PMSF)、D液(10 g/L NaCl，1 mmol/L PMSF)洗滌，接著再用A液洗滌以除去胞內(nèi)雜質(zhì)，結(jié)束后再用超純水洗滌沉淀數(shù)次以除去殘留物，離心收集沉淀，冷凍干燥即得PTR-MCW。

1.2.2 PTR菌絲體細(xì)胞壁組分的分離與純化

PTR-MCW組分的分離純化方案如圖1所示，凍干的PTR-MCW粉末分別用熱水(100 ℃)、常溫堿溶液(0.5、1 mol/L NaOH)、熱堿溶液(1 mol/L NaOH，80 ℃)浸提，每種提取液均離心(4 ℃，4 000×g，10 min)取上清，分別命名為MHW、MCA-1、MCA-2和MHA，最后剩下的沉淀為堿不溶物MAI。提取步驟均重復(fù)5次，合并相應(yīng)提取液。

將熱水提取液混合濃縮至1/5體積后按體積比1∶4攪拌加入無(wú)水乙醇靜置過(guò)夜，離心收集沉淀得到MHW；3種堿提組分(MCA-1、MCA-2和MHA)經(jīng)醋酸溶液中和后，分別按1∶3的體積比加入無(wú)水乙醇靜置過(guò)夜，離心收集沉淀，再分別用75%(體積分?jǐn)?shù))酒精洗滌沉淀8次；MAI用雙蒸水洗滌至中性以除去化學(xué)殘留。

用截留量為10 kDa的超濾膜對(duì)堿溶性組分作初步純化，得到分子質(zhì)量分別大于10 kDa(MCA-1I、MCA-2I和MHA-I)和小于10 kDa(MCA-1Ⅱ、MCA-2Ⅱ、MHA-Ⅱ)的兩類(lèi)組分。對(duì)于MCA-1I、MCA-2I和MHA-I，采用在Sephacryl S-1000色譜柱與Sephacryl S-400色譜柱聯(lián)用分離，以0.2 mol/L NaCl溶液為洗脫液在1.5 mL/min的速度洗脫純化，收集合并相應(yīng)組分。MCA-1Ⅱ、MCA-2Ⅱ和MHA-Ⅱ通過(guò)Sephacryl S-200色譜柱用同樣的洗脫液和流速進(jìn)行洗脫，進(jìn)一步純化為單一組分。所有純化的組分分別合并后過(guò)Sephadex G10色譜柱用超純水洗脫除鹽，冷凍干燥。

圖1 PTR菌絲體組分的分離純化步驟

1.2.3 PTR-MCW組分分析

1.2.3.1 PTR-MCW組分化學(xué)成分分析

總糖、糖醛酸和蛋白含量的測(cè)定分別采用苯酚-硫酸法[7]、硫酸-間羥基聯(lián)苯法[8]和 BCA法[9]。

精確稱(chēng)取10 mg純化的多糖以硫酸水解，取水解后的樣品及標(biāo)準(zhǔn)品分別用硼氫化鈉還原，并用乙酸終止反應(yīng)；再加入1-甲基咪唑和乙酸酐進(jìn)行單糖的衍生化，之后用二氯甲烷進(jìn)行萃取，GC-MS上機(jī)分析單糖組成[10]。GC-MS條件如下：色譜柱Thermo ScientificTMTrace GOLD TG-5MS GC Columns(30 m×0.25 mm i.d., 0.25 μm 濾膜)；載氣為氦氣；升溫程序?yàn)?0 ℃、1 min、50～150 ℃(10 ℃/min)、150～200 ℃(1 ℃/min)、200～280 ℃(20 ℃/min)、280 ℃持續(xù)5 min；MS條件為離子源溫度200 ℃，電子能量70 eV，檢測(cè)器電壓1.5 kV，質(zhì)量掃描范圍33～550。

1.2.3.2 糖苷鍵構(gòu)成分析

多糖的糖苷鍵構(gòu)成采用甲基化衍生結(jié)合GC-MS分析的方法[11]，稱(chēng)取干燥的多糖樣品3 mg依次加入200 μL二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)、100 μg NaOH粉末，吹吸混勻；加入碘甲烷進(jìn)行甲基化反應(yīng)3 h，用超純水終止反應(yīng)，然后用二氯甲烷進(jìn)行萃取，氮?dú)獯蹈?；?jīng)水解、還原后，進(jìn)行乙?；苌玫讲糠旨谆奶谴家宜狨?partially methylated alditol acetates，PMAAs)，之后用二氯甲烷進(jìn)行萃取，GC-MS上機(jī)分析。GC-MS條件如下，色譜柱Thermo ScientificTMTrace GOLD TG-5MS GC Columns(30 m×0.25 mm i.d., 0.25 μm 濾膜)；載氣為氦氣；升溫程序?yàn)?0 ℃ 2 min、50～150 ℃(20 ℃/min)、150～200 ℃(3 ℃/min)、200～280 ℃(20 ℃/min)、280 ℃持續(xù)7 min；MS條件為：離子源溫度200 ℃，電子能量70 eV，探測(cè)器電壓1.5 kV，質(zhì)量掃描范圍33～550。

1.2.3.3 多糖的FT-IR分析

稱(chēng)取1 mg多糖樣品，充分干燥后采用KBr壓片法[12]進(jìn)行傅里葉變換紅外光譜掃描，掃描范圍為4 000～400 cm-1。

1.2.3.4 多糖分子量及分子構(gòu)象分析

采用多角度激光光散射凝膠色譜系統(tǒng)(size exclusion chromatography-multiangle laser light scattering，SEC-MALLS)分析多糖的重均分子量(weight-average molecular mass，Mw)、均方根半徑(root mean square radius, R.M.S. radius，又稱(chēng)回轉(zhuǎn)半徑，Radius of gyration,rg)[13]。MALLS光源為He-Ne激光源，波長(zhǎng)為690 nm。所用凝膠柱為Ultrahydrogel@TM 2000(30 cm×7.8 mm i.d.)，流動(dòng)相為0.1 mol/L NaNO3溶液(用0.2 μm濾膜過(guò)濾，并且超聲脫氣),流速0.5 mL/min,柱溫25 ℃。取經(jīng)脫氣處理的流動(dòng)相溶解多糖樣品，樣品質(zhì)量濃度為1 g/L。Astra軟件用于實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采集與結(jié)果分析。

采用Zimm擬合法及公式(1)進(jìn)行數(shù)據(jù)處理[14]，即可得到多糖的Mw、R.M.S. radius等參數(shù):

(1)

1.2.4 電鏡分析

對(duì)1.2.1中粉碎過(guò)篩的虎奶菇菌絲體粉末、菌絲體細(xì)胞壁PTR-MCW及純化并凍干后的MHA-I粉末進(jìn)行SEM分析。取適量樣品粉末，使其分散在樣品板上，清除不被黏附的樣品粉末，使得樣品板上僅保留薄薄的一層待測(cè)樣品，噴金后在10.0 kV下進(jìn)行SEM觀(guān)察[15]。為了進(jìn)一步觀(guān)測(cè)MHA-I的微觀(guān)形態(tài)，將其充分分散溶解后進(jìn)行TEM分析。將MHA-I多糖樣品制成1 g/L的水溶液，與等體積1 g/L的SDS溶液混合，80 ℃加熱2 h，梯度稀釋至5 μg/mL，再80 ℃加熱2 h，將樣品滴在200目的多孔碳膜上，室溫環(huán)境下干燥，80 kV下進(jìn)行TEM觀(guān)察[16]。

1.2.5 數(shù)據(jù)處理

所有試驗(yàn)均采用3次平行設(shè)計(jì)(n=3)，試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Sigma plot 14.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)和作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 PTR菌絲體細(xì)胞壁的含量與組成

采用不同的溶劑對(duì)PTR-MCW進(jìn)行提取分離，得到的組分及含量如表1所示。菌絲體細(xì)胞壁僅占干重(dry weight，DW)的(19.1±0.3)%，明顯低于菌核[(78.4±0.7)% DW][5]和子實(shí)體[(46.6±0.9)% DW][10]，說(shuō)明PTR在不同生長(zhǎng)階段的細(xì)胞壁構(gòu)成及形態(tài)特征具有明顯差異。由表1可知，PTR菌絲體細(xì)胞壁中碳水化合物質(zhì)量分?jǐn)?shù)為79.0%，糖醛酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5.06%，蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3.79%，各成分的比例與虎奶菇菌核和子實(shí)體中相應(yīng)組分含量一致[5, 10]。

MCW分離后，熱水提部分(MHW)占細(xì)胞壁的2.06%，其中蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)為55.61%，而總糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)為41.3%(表1)。因此，菌絲細(xì)胞壁中可能含有少量水溶性蛋白質(zhì)、多糖或糖蛋白組分。堿提組分(MCA-1、MCA-2和MHA)主要由碳水化合物和微量的糖醛酸組成，其中常溫堿提組分(MCA-1、MCA-2)和熱堿提組分(MHA)的含量分別占細(xì)胞壁干重22.06%和46.97%，與之前測(cè)定的PTR子實(shí)體細(xì)胞壁中相應(yīng)組分含量(子實(shí)體常溫堿提組分FCA和子實(shí)體熱堿提組分FHA分別為20.5%和52.4%)接近[10]，但與PTR菌核細(xì)胞壁中相應(yīng)組分的質(zhì)量分?jǐn)?shù)(菌核常溫堿提組分SCA和菌核熱堿提組分SHA分別為41.2%和35.3%)[5]差異較大。此外，堿不溶性組分(MAI)中可測(cè)到的碳水化合物質(zhì)量分?jǐn)?shù)僅為45.7%，未檢測(cè)到糖醛酸和蛋白質(zhì)。

根據(jù)以上結(jié)果和溶劑提取強(qiáng)度順序(由弱到強(qiáng))，預(yù)測(cè)PTR-MCW成分由外層到內(nèi)層依次為水提多糖、蛋白質(zhì)或糖蛋白，堿提多糖，不溶性多糖-幾丁質(zhì)復(fù)合物。

表1 PTR菌絲體細(xì)胞壁的組成成分 單位：%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))

注：a，苯酚-硫酸法檢測(cè)不到幾丁質(zhì)中的葡萄糖胺[17]；-代表無(wú)(下同)

由于細(xì)胞壁分離過(guò)程采用由弱到強(qiáng)的溶劑提取強(qiáng)度，以過(guò)往文獻(xiàn)記載，所提取到細(xì)胞壁組分的順序依次由外而內(nèi)[18]。由此推斷，PTR-MCW組分由外而內(nèi)的順序?yàn)镸HW、MCA-1I、MCA-2I、MHA-I、MAI。PTR-MCW水溶性粗提物含量較低，且含有大量的蛋白質(zhì)，所以對(duì)于MHW不進(jìn)行進(jìn)一步純化，只分析其單糖組成；堿溶性組分經(jīng)超濾膜純化后，得到分子量較大的組分MCA-1I、MCA-2I和MHA-I，柱層析法進(jìn)行純化之后，分別從MCA-1I、MCA-2I和MHA-I中獲得單一組分。對(duì)于分子量較小的組分MCA-1Ⅱ, MCA-2Ⅱ和MHA-Ⅱ，柱層析純化之后，收集到樣品含量極低。因此，純化MCW多糖的分析主要集中于3種占主要成分的大分子可溶性組分MCA-1I、MCA-2I和 MHA-I。

2.2 細(xì)胞壁多糖的結(jié)構(gòu)分析

2.2.1 PTR菌絲體細(xì)胞壁多糖的制備與組分分析

經(jīng)檢測(cè)，純化多糖中不含糖醛酸，因此乙酰化衍生后采用GC-MS檢測(cè)單糖組成。如表2所示[19]，水提物MHW中含有較多的甘露糖、木糖、鼠李糖和半乳糖，隨溶劑提取強(qiáng)度的增強(qiáng)，上述幾種單糖組成含量依次降低，而葡萄糖含量逐步增加，具有明顯的規(guī)律性。相比之下，不溶性組分MAI除含有質(zhì)量分?jǐn)?shù)為41.90%葡萄糖外，還含有58.10%的氨基葡萄糖(幾丁質(zhì)的結(jié)構(gòu)亞基)。因此，MAI由葡聚糖-幾丁質(zhì)復(fù)合物組成[20]。

表2 PTR菌絲體細(xì)胞壁組分的單糖組成 單位：%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))

2.2.2 糖苷鍵構(gòu)成分析

由于MCA-1I和MCA-2I在DMSO中的溶解度很低，無(wú)法順利進(jìn)行甲基化衍生和糖苷鍵構(gòu)成分析，所以只對(duì)PTR-MCW的主要多糖組分MHA-I進(jìn)行糖苷鍵構(gòu)成分析。將GC-MS總離子色譜圖(total ions chromatograph，TIC)中不同峰的質(zhì)譜圖與CCRC在線(xiàn)數(shù)據(jù)庫(kù)中的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)譜圖比對(duì)[21]，對(duì)MHA-I中糖苷鍵類(lèi)型進(jìn)行鑒定(表3)，再根據(jù)TIC中單糖的峰面積和響應(yīng)因子計(jì)算單糖殘基的摩爾比[22]。

由質(zhì)譜數(shù)據(jù)分析結(jié)果(表3)可知，MHA-I主要由T-葡萄糖(末端葡萄糖)、1,3-葡萄糖、1,4-葡萄糖、1,6-葡萄糖、1,3,6-葡萄糖和1,4,6-葡萄糖組成，此外，還含有少量T-木糖(末端木糖)、T-鼠李糖(末端鼠李糖)、1,3,6-甘露糖。其中鼠李糖、木糖、甘露糖和葡萄糖的質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為0.7%、1.2%、2.9%和95.3%，此結(jié)果與單糖組成分析結(jié)果一致(表2)。

分支度的計(jì)算公式為DB= (NT+NB)/(NT+NB+NL)[23]，其中NT、NB和NL分別指末端殘基、分支殘基和線(xiàn)性殘基的摩爾量，經(jīng)計(jì)算，MHA-I的DB值為0.45，因此認(rèn)為MHA-I是一種超支化的雜多糖。

表3 甲基化分析MHA-I中糖苷鍵峰面積和摩爾比

注：a,T-Xylp, 末端吡喃木糖；T-Rhap, 末端吡喃鼠李糖；T-Glcp, 末端吡喃葡萄糖；Manp, 吡喃甘露糖；b,TU/BP (terminal units/branching points),末端單元/分支單元；c,DB (degree of branching),分支度

2.2.3 紅外光譜分析

MHA-I的紅外光譜如圖2所示，在3 200～3 500 cm-1、2 700～3 000 cm-1、1 000～1 800 cm-1均有強(qiáng)吸收峰。其中，3 383 cm-1處的寬峰為—OH的伸縮振動(dòng)，2 891 cm-1處的吸收峰是C—H的振動(dòng)，1 638 cm-1處的吸收峰是由于羰基C—O—C鍵的伸縮振動(dòng)，1 072、1 042 cm-1處的吸收峰表明MHA-I是吡喃糖905 cm-1處有吸收峰表明,MHA-I含有β-吡喃糖苷鍵[24]。

圖2 MHA-I的紅外光譜圖

2.2.4 MHA-I分子量及分子構(gòu)象

采用分子排阻色譜-多角度激光光散射聯(lián)用系統(tǒng)(SEC-MALLS)測(cè)定多糖的分子量分布及多糖分子的構(gòu)象信息。如圖3所示，對(duì)稱(chēng)性較好的單峰表明MHA-I組分單一，具有較高的純度(99.92%)；圖4顯示純化多糖MHA-I的(Rθ/Kc)c=0角度依賴(lài)關(guān)系。

圖3 MHA-I的SEC-MALLS色譜圖

圖4 MHA-I的(Rθ/Kc)c=0值與光散射角度的關(guān)系

MHA-I是從占細(xì)胞壁干重46.97%的MHA中純化出的主要組分，表明該組分構(gòu)成PTR-MCW的骨架。根據(jù)公式(1)和圖4計(jì)算得到，MHA-I的Mw為4.502×104g/mol(表4)，由圖4的角度依賴(lài)的斜率得出R.M.S. 半徑為33.2 nm。多分散系數(shù)(polydispersity index, PDI)反映了分子Mw的均一性，可由Mw/Mn計(jì)算得到，對(duì)于單分散分子，其值接近于1[25]。表4中Mw/Mn=1.154表明MHA-I具有較高的純度。分形維數(shù)(df)是評(píng)價(jià)聚合物結(jié)構(gòu)致密性的參數(shù)，df值越大，聚合物結(jié)構(gòu)越致密。剛性桿或棒狀結(jié)構(gòu)分子的df值為1，無(wú)規(guī)則卷曲的線(xiàn)性聚合物的df值在5/3～2。分支殘基越多，其df值越大，df=3代表具有理想三維空間結(jié)構(gòu)的高分子[26]。df值可以根據(jù)公式(2)、公式(3)確定：

(2)

df=1/v

(3)

式中：指數(shù)v反映了聚合物的分子形狀，當(dāng)其值為0.33、0.50～0.60和1.0，分別表示球體、隨機(jī)線(xiàn)圈和剛性桿的分子形狀[27]。MHA-I的v值為0.37，對(duì)應(yīng)的df值為2.69(表4)，表明MHA-I的構(gòu)象接近球形。

表4 MHA-I的SEC-MALLS分析結(jié)果

注：Mn，數(shù)均分子量；df，分形維數(shù)

與PTR菌核、子實(shí)體細(xì)胞壁(分別為SCA-I、FHA-I)[5, 10]多糖相比，MHA-I的Mw相對(duì)較小，且單糖組成較復(fù)雜，但是它們都被鑒定為超支化多糖；此外，糖苷鍵構(gòu)成分析發(fā)現(xiàn)，SCA-I、FHA-I和MHA-I中主要的糖苷鍵類(lèi)型一致，但MHA-I中含有更多其他類(lèi)型的末端殘基。

2.2.5 菌絲體及細(xì)胞壁形態(tài)觀(guān)察

為了直觀(guān)觀(guān)測(cè)虎奶菇菌絲體及其細(xì)胞壁主要組分的微觀(guān)形態(tài)，將相應(yīng)組分進(jìn)行電鏡觀(guān)測(cè)(圖5)。由虎奶菇菌絲體粉碎后的SEM圖像(圖5-a)可知，粉碎過(guò)篩后斷裂均勻，呈現(xiàn)表面形貌光滑的管狀結(jié)構(gòu)；與完整的菌絲體相比，細(xì)胞壁由于失去了胞內(nèi)物質(zhì)的支撐，并且在洗滌提取過(guò)程中經(jīng)過(guò)了溶劑等的破壞作用而呈現(xiàn)表面粗糙的片狀結(jié)構(gòu)(圖5-b)。而作為細(xì)胞壁的主要構(gòu)成組分MHA-I在凍干后的SEM圖像則呈現(xiàn)準(zhǔn)球形的顆粒狀態(tài)(圖5-c)，結(jié)果與SEC-MALLS結(jié)果一致。為了進(jìn)一步觀(guān)察MHA-I的微觀(guān)形態(tài)，將其用SDS溶液溶解分散后以TEM觀(guān)察，如圖5-d所示，MHA-I分子為舒展的高分支聚合物，該結(jié)果與甲基化結(jié)果一致。因此，MHA-I組分為具有超支化結(jié)構(gòu)特征的雜多糖聚合物，在干燥的粉末狀態(tài)下和水溶液中呈現(xiàn)準(zhǔn)球形，這也是超支化多糖的特點(diǎn)之一。

基于以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果，初步預(yù)測(cè)PTR菌絲體細(xì)胞壁的結(jié)構(gòu)為：細(xì)胞壁表面主要是可用沸水提取的蛋白，多糖和/或聚糖-蛋白復(fù)合物；細(xì)胞壁的第二部分是以葡萄糖為主的雜多糖，可以用不同濃度的常溫堿溶液提?。坏谌M分由于含量較高，可認(rèn)為是菌絲細(xì)胞壁的結(jié)構(gòu)骨架，主要由具有超支化結(jié)構(gòu)的葡聚糖構(gòu)成，另含有少量的甘露糖、木糖和鼠李糖，可用80 ℃熱堿溶液提?。黄暇厶呛蛶锥≠|(zhì)的復(fù)合物形成了細(xì)胞壁的第四部分，即使熱堿溶液也不能將其從菌絲細(xì)胞壁中提取出來(lái)。

PTR-CWM的結(jié)構(gòu)骨架與其子實(shí)體[10]類(lèi)似，但超支化葡聚糖骨架中含有少量甘露糖、木糖等組分。與雙孢菇菌絲體細(xì)胞壁[28]結(jié)構(gòu)相比，它們菌絲體細(xì)胞壁的內(nèi)層均為堿不溶性的多糖-幾丁質(zhì)復(fù)合物。不同的是，PTR-MCW的糖蛋白組分更多地集中于細(xì)胞壁的外層，而在雙孢菇中糖蛋白貫穿整個(gè)菌絲體細(xì)胞壁；此外，雙孢菇菌絲體細(xì)胞壁中的堿溶性多糖主要是葡聚糖，而PTR中是以葡聚糖為主的超支化雜多糖。

3 結(jié)論

本研究通過(guò)采用不同溶劑對(duì)PTR-MCW組分進(jìn)行分離，得到4種細(xì)胞壁組分，分別為MHW、MCA、MHA、MAI，其比例為2.06∶22.06∶46.97∶18.95。從細(xì)胞壁主要組分MHA中純化出的多糖MHA-I主要含有葡萄糖和少量甘露糖、木糖、鼠李糖。甲基化分析及FT-IR表明，MHA-I含有T-葡萄糖、1,4-葡萄糖、1,6-葡萄糖、1,3,6-葡萄糖等9種β-糖苷鍵，DB計(jì)算為0.45。結(jié)合SEC-MALLS分析結(jié)果可知，MHA-I為一種具有超支化結(jié)構(gòu)的雜多糖，其分子量和半徑分別為4.502×104g/mol、33.2 nm。電鏡分析證實(shí)了MHA-I的超支化結(jié)構(gòu)，而且該多糖在干燥的粉末狀態(tài)下呈現(xiàn)準(zhǔn)球形結(jié)構(gòu)。本研究結(jié)果為探究細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)提供了新的思路和方法，PTR菌絲體作為一種重要的膳食纖維的來(lái)源，在食品工業(yè)等領(lǐng)域具有廣泛的研究?jī)r(jià)值。