李 澤，王茜茜，溫鶯芬，郭文靖，趙令齋，洪文昕，張復(fù)春，庾 蕾

（廣州醫(yī)科大學(xué)附屬?gòu)V州市第八人民醫(yī)院，廣東廣州 510060）

登革熱（dengue fever，DF）是登革病毒經(jīng)蚊媒傳播引起的一種急性全身性疾?。?］。2014 年廣東省爆發(fā)了近十年來(lái)最嚴(yán)重的登革熱疫情，主要為登革病毒血清1 型感染（DENV-1），出現(xiàn)了重癥甚至死亡病例［2］。登革病毒感染可導(dǎo)致嚴(yán)重的血漿滲漏、血小板減少、嚴(yán)重出血及器官損害等，即重癥登革熱（severe dengue，SD），如不及時(shí)救治會(huì)危及生命［3］。重癥登革熱的發(fā)病機(jī)制仍不清楚，目前普遍認(rèn)為二次感染是重癥登革熱發(fā)生的危險(xiǎn)因素［4-6］。有研究報(bào)道二次感染時(shí)顯著的漿細(xì)胞擴(kuò)增與疾病的嚴(yán)重性相關(guān)［7］。目前，與病毒感染所誘導(dǎo)機(jī)體免疫反應(yīng)的相關(guān)研究，多數(shù)集中于血清抗體反應(yīng)，而缺乏對(duì)產(chǎn)生抗體的B 細(xì)胞反應(yīng)的研究，特別是在出現(xiàn)臨床癥狀的急性期。本文以2014 年因登革病毒感染住院病例為研究對(duì)象，探討了DENV-1 感染時(shí)，機(jī)體B 細(xì)胞和漿細(xì)胞隨病程的動(dòng)態(tài)變化及其與疾病嚴(yán)重性的關(guān)系。從B 細(xì)胞反應(yīng)的角度探討機(jī)體抗體反應(yīng)機(jī)制，為重癥登革熱的早期預(yù)警和早期治療提供可能的依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 臨床樣本

1.1.1 樣本來(lái)源 選擇2014 年9 月至12 月，廣州市第八人民醫(yī)院住院確診的DENV-1 患者急性期或極期（即病程3～11 d）外周血樣本，病例總數(shù)62 例，樣本數(shù)共97 份。所選樣本均用于醫(yī)學(xué)研究，已征得患者或家屬知情同意，并通過(guò)我院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。登革熱診斷和臨床分型參照國(guó)家衛(wèi)生計(jì)生委《登革熱診療指南（2014 年第2 版）》［8］。登革病毒初次和二次感染判定，依據(jù)登革病毒感染者IgM 和IgG 在病程中的動(dòng)態(tài)變化。認(rèn)為病程5 d 內(nèi)可檢測(cè)到登革病毒特異性IgM 或第8～10 天檢測(cè)到IgG 出現(xiàn)且升高為初次感染；認(rèn)為病程開(kāi)始檢測(cè)到IgG 持續(xù)且迅速升高為二次感染［1］。

1.1.2 研究分組 研究分為輕癥登革熱組和重癥登革熱組。輕癥組（DF，n=33），單時(shí)間點(diǎn)病例數(shù)30 例，包括登革病毒初次感染20 例，二次感染10 例；系列時(shí)間點(diǎn)病例數(shù)3 例，樣品數(shù)18 份。重癥組（SD，n=29），單時(shí)間點(diǎn)病例數(shù)26 例，包括登革病毒初次感染14 例，二次感染12 例；系列病例數(shù)3 例，樣品數(shù)23 份。選擇同期門(mén)診發(fā)熱且排除登革熱患者的外周血作為對(duì)照組（control，n=6），樣品數(shù)共6 份。輕癥登革熱組包括男性15 例，女性18 例，年齡17～82 歲，年齡M（QR）為46（37.5）歲；重癥登革熱組包括男性16 例，女性13 例，年齡17～98歲，年齡M（QR）為69（52.5）歲；經(jīng)檢驗(yàn)兩組性別（χ2=0.583，P=0.445）、年齡（Z=-1.799，P=0.072）均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

1.2 試劑及儀器

淋巴細(xì)胞分離液（GE Healthcare，美國(guó)）；B 細(xì)胞及其亞群標(biāo)志抗原熒光抗體試劑盒（Beckman，美國(guó)），包括：CD45-KO、CD19-ECD、IgD-FITC、CD27-PC7、IgM-PB 和CD38-APC A750；流式細(xì)胞儀（BeckmanGallios 流式細(xì)胞儀，美國(guó)）

1.3 方 法

1.3.1 外周血單個(gè)核細(xì)胞分離及保存 取病例組以及對(duì)照組EDTA 抗凝血5 mL，離心分離血漿后，重懸下層細(xì)胞，并加入GE-淋巴細(xì)胞分離液充分混勻，再次離心后收集外周血單個(gè)核細(xì)胞（peripheral blood mononuclear cell，PBMC），計(jì)數(shù)保存于液氮。

1.3.2 多色流式細(xì)胞技術(shù)分析 解凍保存于液氮中的PBMC，將實(shí)驗(yàn)設(shè)置為空白細(xì)胞管、單個(gè)抗體染色管（CD45-KO、CD19-ECD、IgD-FITC、CD27-PC7、IgM-PB 和CD38-APC A750 抗體）以及上述混合抗體染色管，振蕩混勻，室溫避光孵育。

期間取實(shí)驗(yàn)室預(yù)存健康人PBMC，設(shè)置調(diào)整Beckman Gallios 流式細(xì)胞儀上機(jī)參數(shù)，待實(shí)驗(yàn)樣品避光孵育結(jié)束后上機(jī)。采用Kaluza1.3 軟件分析收集上機(jī)數(shù)據(jù)，首先通過(guò)CD45-KO 抗體熒光確認(rèn)標(biāo)記CD45 的外周血單個(gè)核細(xì)胞范圍，從中以CD19-ECD 抗體熒光圈出B 細(xì)胞（CD19+），再依次找出B 細(xì)胞亞群，包括初始B 細(xì)胞（IgD+CD27-）、記憶B細(xì)胞（CD27+CD38low）和漿細(xì)胞（CD27++CD38++），最終計(jì)算各自所占比率。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

數(shù)據(jù)應(yīng)用SPSS 25.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件分析。計(jì)數(shù)資料以例數(shù)統(tǒng)計(jì)描述，采用Pearson 卡方檢驗(yàn)統(tǒng)計(jì)分析；計(jì)量資料符合正態(tài)分布，采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（），不符合正態(tài)分布，采用中位數(shù)（四分位間距）即M（QR）描述；多組計(jì)量資料符合正態(tài)分布且方差齊性，采用單因素方差分析（one-way ANOVA），有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義時(shí)進(jìn)行多重比較（LSD 法）。非正態(tài)分布資料且方差齊性，采用Wilcoxon 檢驗(yàn)，多組比較采用Kruskal-WallisH檢驗(yàn)，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義時(shí)進(jìn)行多重比較。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 輕癥與重癥登革熱B 細(xì)胞反應(yīng)動(dòng)態(tài)變化

為了解登革病毒感染所誘導(dǎo)的宿主抗體反應(yīng)與疾病嚴(yán)重性是否相關(guān)，本研究首先觀察了輕癥與重癥登革熱患者的B 細(xì)胞反應(yīng)變化。我們選取輕癥組單時(shí)間點(diǎn)病例（DF，n=30）、重癥組單時(shí)間點(diǎn)病例（SD，n=26），以及對(duì)照組（control，n=6），分析各組中B 細(xì)胞占PBMC 的比率（圖1A）。經(jīng)檢驗(yàn)3 組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（H=10.213，P=0.006），兩兩比較后可知，重癥組相較輕癥組與對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.013，0.023），且重癥組B 細(xì)胞比率高于其他兩組，而輕癥組與對(duì)照組相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=1.000）。為進(jìn)一步探討B(tài) 細(xì)胞反應(yīng)隨感染病程的變化，我們分析了輕癥、重癥組B 細(xì)胞比率與發(fā)熱起病天數(shù)的關(guān)系（圖1B）。由圖可知，輕癥和重癥組B 細(xì)胞反應(yīng)呈現(xiàn)不同的趨勢(shì)。重癥組B 細(xì)胞比率在病程的第5 和6天明顯高于輕癥組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=10.650，20.188；P=0.017，0.002）。即重癥在感染后第5 和6 天B 細(xì)胞增殖明顯高于輕癥感染者。

圖1 輕癥與重癥登革熱組B 細(xì)胞變化比較Fig.1 Comparison of B cell percentage in PBMC between mild and severe denguevirus infection groups

2.2 漿細(xì)胞在輕癥和重癥登革熱病程中的變化趨勢(shì)

2.2.1 單時(shí)間點(diǎn)輕、重癥組漿細(xì)胞變化 為進(jìn)一步分析輕癥和重癥患者急性期B 細(xì)胞不同程度的擴(kuò)增，是否與其漿細(xì)胞擴(kuò)增相關(guān)，我們觀察了輕、重癥登革熱單時(shí)間點(diǎn)病例以及對(duì)照組的漿細(xì)胞，在病程中的變化規(guī)律。圖2A 顯示輕癥和重癥組漿細(xì)胞與對(duì)照組相比均有明顯的增殖，經(jīng)檢驗(yàn)上述3 組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（H=8.525，P=0.014），其中輕癥和重癥組相比對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.011，0.032），但輕癥組和重癥組相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=1.000）。從感染病程的角度觀察（圖2B），發(fā)現(xiàn)輕癥組在病程第7 天漿細(xì)胞擴(kuò)增達(dá)高峰，而重癥組在病程第8 天達(dá)高峰，但兩組之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=3.065，0.008；P=0.099，0.931）。

圖2 輕癥與重癥登革熱組漿細(xì)胞變化比較Fig.2 Comparison of Plasmblast percentage in B cell between mild and severe dengue groups

2.2.2 系列時(shí)間點(diǎn)輕、重癥組漿細(xì)胞變化 從來(lái)源于同一感染者的系列樣品（輕癥和重癥各3 例）分析漿細(xì)胞隨病程的變化。圖中表明輕癥病例（圖3A）漿細(xì)胞在病程第7～8 天達(dá)高峰，第10 天基本恢復(fù)正常。重癥病例（圖3B）在病程第7～9 天達(dá)高峰，但在病程10 d后仍有一定量的漿細(xì)胞增值。

圖3 登革病毒感染者漿細(xì)胞隨感染病程的變化Fig.3 The dynamics of Plasmablasts in series samples from the dengue during the course of disease

2.3 初次和二次感染對(duì)B 細(xì)胞反應(yīng)的影響

本研究中我們以輕癥和重癥登革熱單時(shí)間點(diǎn)病例作為研究對(duì)象，分析病毒初次（primary infection）和二次感染（secondary infection）時(shí)B 細(xì)胞（B cell）及其亞群，即初始B 細(xì)胞（naive B cell）、記憶B 細(xì)胞（memory B cell）和漿細(xì)胞（plasmablast）的變化。在圖4 A～D 所示的四類不同細(xì)胞群中，輕癥初次、二次感染以及對(duì)照組差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（從A～D 的H分別為7.053，19.822，20.843，8.188；P分別為0.029，＜0.001，＜0.001，0.017），其中輕癥二次感染組相較初次感染組，表現(xiàn)為B 細(xì)胞增殖、初始B 細(xì)胞減少和記憶B 細(xì)胞減少（P=0.028，0.010，0.037），但漿細(xì)胞變化無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.434）；在圖4 A 至D 所示的四類不同細(xì)胞亞群中，重癥初次、二次感染組以及對(duì)照組，在B 細(xì)胞中的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=2.227，P=0.126），而在初始B 細(xì)胞、記憶B 細(xì)胞和漿細(xì)胞群中差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F分別為8.121，35.594，3.611；P分別為0.002，＜0.001，0.040）。其中重癥初次、二次感染組，在初始B 細(xì)胞亞群中存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P=0.018），表現(xiàn)為二次感染時(shí)初始B 細(xì)胞明顯減少，而在記憶B 細(xì)胞和漿細(xì)胞亞群中差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.469，0.154）。

圖4 登革病毒感染者B 細(xì)胞及其亞群與初次與二次感染的關(guān)系Fig.4 Comparison of B cell and its subsets between primary and secondary infection in dengue fever

3 討論

典型登革熱病程分為3 期，即急性發(fā)熱期、退熱期或極期和恢復(fù)期。極期通常出現(xiàn)在病程的第6～7 天，部分患者在此期發(fā)熱減退時(shí)可出現(xiàn)病情加重，發(fā)展成為重癥登革熱［9］。早期預(yù)警和干預(yù)是救治重癥登革熱及降低病死率的關(guān)鍵。本研究初步觀察了登革病毒感染時(shí)B 細(xì)胞隨病程的變化，發(fā)現(xiàn)在病程的第5～6 天B 細(xì)胞明顯增殖且與疾病的嚴(yán)重性相關(guān)，而在病程早期出現(xiàn)的B 細(xì)胞明顯擴(kuò)增現(xiàn)象是否可作為登革熱的重癥預(yù)警指標(biāo)還需進(jìn)一步明確。

現(xiàn)許多研究報(bào)道認(rèn)為登革病毒感染可誘導(dǎo)人體B 細(xì)胞大量快速增殖，其中漿細(xì)胞為主要組分［10-11］。另有研究報(bào)道證實(shí)登革病毒感染引起的漿細(xì)胞反應(yīng)程度遠(yuǎn)大于接種疫苗或者感染其他發(fā)熱性疾病［5］。本研究觀察到登革病毒感染后，無(wú)論輕癥或重癥登革熱患者均可見(jiàn)漿細(xì)胞的大量擴(kuò)增，這與上述報(bào)道的結(jié)果一致。目前有關(guān)漿細(xì)胞擴(kuò)增與登革熱疾病進(jìn)展相關(guān)性的報(bào)道仍較少，而在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)僅比較輕癥與重癥登革熱漿細(xì)胞的擴(kuò)增是無(wú)明顯差異的，但輕癥與重癥漿細(xì)胞擴(kuò)增隨病程的變化規(guī)律不同。從病程角度觀察，輕癥登革熱組中的漿細(xì)胞在發(fā)熱起病第7～8 天達(dá)高峰，于第10 天基本恢復(fù)至正常水平，而重癥登革組中的漿細(xì)胞在病程第7～9 天達(dá)高峰，且在病程第10 天后仍維持一定量的漿細(xì)胞擴(kuò)增，我們推測(cè)這種漿細(xì)胞延遲反應(yīng)可能與疾病嚴(yán)重性相關(guān)。

現(xiàn)已明確B 細(xì)胞是由功能不同的細(xì)胞亞群組成，但各細(xì)胞亞群在登革病毒感染中的作用尚不清楚。不同血清型登革病毒二次感染時(shí)所產(chǎn)生的抗體依賴性感染增強(qiáng)作用（antibody dependent enhancement，ADE）可導(dǎo)致疾病進(jìn)展為重癥表現(xiàn)［3，4，12-13］。本研究觀察了B 細(xì)胞及各亞群在輕癥、重癥登革熱中的變化與初次、二次感染之間的關(guān)系。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，二次感染時(shí)輕癥和重癥登革熱組初始B 細(xì)胞均表現(xiàn)為明顯減少，提示二次感染時(shí)可能由B 細(xì)胞的其他亞群發(fā)揮主要作用。此外，本研究還發(fā)現(xiàn)記憶B 細(xì)胞的增殖在初次感染和二次感染中的差異并無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但有報(bào)道認(rèn)為登革病毒二次感染時(shí)，機(jī)體中已存在的記憶B 細(xì)胞被激活，發(fā)揮主要作用［14-16］。這與本研究中所觀察到的現(xiàn)象似乎并不一致，而這是否同個(gè)體免疫、樣本數(shù)量或者病程有關(guān)，仍需要進(jìn)一步明確。

總之，我們觀察了DENV-1 血清型感染時(shí)B細(xì)胞反應(yīng)隨病程的變化以及在輕癥和重癥登革熱之間的差異。研究表明登革熱病程早期B 細(xì)胞的明顯擴(kuò)增以及漿細(xì)胞延遲反應(yīng)可能與疾病嚴(yán)重性相關(guān)。