位俊敏，李銳鋒，楊冬陽(yáng)，賴(lài)曉嶸，劉婉薇，蔡先彬，賁曉松，李子俊，1

（1.南方醫(yī)科大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院，廣東廣州510515，2.廣東省人民醫(yī)院//廣東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院，廣東廣州510080，3.汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院，廣東汕頭 515041）

食管癌是全球第九大常見(jiàn)癌癥，也是世界上第六大癌癥死亡原因，2018 年估計(jì)有572 034 個(gè)新發(fā)病例和508 585 人死亡［1］。食管鱗癌約占食管癌總發(fā)病率的90%，中國(guó)約占全球食管癌總發(fā)病率的50%［2］。食管鱗癌的病因尚未清楚，既往認(rèn)為與飲酒、吸煙、熱飲等生活習(xí)慣有關(guān)。隨著分子生物學(xué)高通量測(cè)序技術(shù)的發(fā)展應(yīng)用，微生態(tài)成為目前研究熱點(diǎn)之一。已有研究證明食管鱗狀細(xì)胞癌患者癌組織及癌旁正常組織發(fā)現(xiàn)牙齦卟啉單胞菌的感染，而健康對(duì)照組食管黏膜無(wú)感染，提示該菌可能在食管鱗癌中的致病作用，且該菌的存在與食管鱗癌的嚴(yán)重程度（即癌細(xì)胞分化和轉(zhuǎn)移）呈正相關(guān)，臨床預(yù)后差［3］。但有關(guān)口腔唾液菌群與食管癌的關(guān)系卻未見(jiàn)報(bào)道。而已有來(lái)自中國(guó)、印度、伊朗等幾個(gè)食管癌高發(fā)地區(qū)及包括拉丁美洲和日本在內(nèi)的多個(gè)地區(qū)的研究表明口腔衛(wèi)生不良指標(biāo)與食管鱗癌之間存在關(guān)聯(lián)［4-7］。眾所周知，口腔微生物群在維持正?？谇簧憝h(huán)境中起著至關(guān)重要的作用?？谇晃⑸锟赡芡ㄟ^(guò)直接代謝化學(xué)致癌物［8-9］和全身炎癥作用［10］在癌癥和其他慢性病中發(fā)揮重要作用。并且已有研究報(bào)道牙齒脫落和口腔衛(wèi)生不良與上消化道癌密切相關(guān)，表明口腔微生物在上消化道癌癥發(fā)生發(fā)展中的可能作用［11-12］。因此，基于以上研究，我們使用16s rDNA測(cè)序方法研究食管鱗癌患者唾液中的口腔微生物菌群，期望在食管鱗癌患者唾液中篩查出特異性表達(dá)的細(xì)菌，為食管鱗癌的早期篩查提供快速簡(jiǎn)單的方法。

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象

于2018 年1-12 月在廣東省人民醫(yī)院（廣東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院）偉倫內(nèi)鏡中心分別收集初診食管鱗癌（ESCC 組）成人患者唾液50 例和正常對(duì)照組（HC 組）成年健康志愿者唾液40 例。所有食管癌患者均經(jīng)病理活檢證實(shí)為食管鱗狀細(xì)胞癌，且無(wú)伴發(fā)其他器質(zhì)性、系統(tǒng)性疾病，如無(wú)肝炎、糖尿病等。健康對(duì)照者為無(wú)器質(zhì)性疾病、系統(tǒng)性疾病、口腔疾病、腫瘤家族史的健康人。具有以下任意一項(xiàng)則為排除對(duì)象：①既往有食管癌放化療及手術(shù)史；②合并其他部位腫瘤、器質(zhì)性疾病、急性口腔感染、HBV、HCV 疾?。虎鄄杉僖呵? 周內(nèi)有腹瀉病史或感染性疾病史；④采集唾液前4 周內(nèi)使用抗生素或PPI 或其他抑酸藥物；⑤采集唾液前4 周內(nèi)服用激素、調(diào)節(jié)腸道菌群相關(guān)藥物，如培菲康、金雙歧、適怡等微生態(tài)制劑；⑥妊娠哺乳期。兩組在年齡、性別比例以及民族3 項(xiàng)指標(biāo)匹配。納入的研究對(duì)象均已簽署知情同意書(shū)。

1.2 研究方法

1.2.1 樣本收集 收集前需禁食、禁飲、禁煙和禁止口腔清潔2 h 以上。收集唾液時(shí)間每日固定為上午8：00～11：00，先使用10 mL 生理鹽水漱口，共漱口3 次，唾液收集量需達(dá)5 mL 以上，收集管使用50 mL 無(wú)菌無(wú)酶離心管。收集的唾液30 min 內(nèi)用冰盒運(yùn)送至-80 ℃冰箱保存以便后續(xù)使用。

1.2.2 DNA 提取及儲(chǔ)存 用UltraClean?Microbial DNA Isolation Kit（美國(guó)，MOBI公司）提取細(xì)菌DNA，DNA 提取方法按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。收集濾液，保存在-20 ℃冰箱。要求DNA 總量≥150 ng；DNA 濃度≥5 ng/μL；有明顯主帶，無(wú)降解、無(wú)RNA和蛋白質(zhì)等雜質(zhì)污染。

1.2.3 16s RNA 測(cè)序及數(shù)據(jù)預(yù)處理 對(duì)合格的DNA 樣品取適量置于離心管中，根據(jù)V4 區(qū)使用帶Barcode 的引物515F 和806R，進(jìn)行PCR，PCR 在緩沖液中進(jìn)行，另外加入2×Premix Taq 引物酶及dNTP，然后進(jìn)行熱循環(huán)，在94 ℃條件下變性5 min，再進(jìn)行30 個(gè)循環(huán)包括94 ℃變性30 s，52 ℃退火30 s 及72 ℃延伸30 s，再于72 ℃充分延伸10 min。最后置于4 ℃保存。用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR 產(chǎn)物的片段長(zhǎng)度和濃度，主帶長(zhǎng)度在正常范圍內(nèi)的樣品可用于進(jìn)一步的研究。利用GeneTools Analysis Software 對(duì)PCR 產(chǎn)物進(jìn)行濃度對(duì)比后，按照等質(zhì)量原則計(jì)算各樣品所需體積，將各PCR 產(chǎn)物進(jìn)行混合。使用E.Z.N.A.Gel Extraction Kit 凝膠回收試劑盒回收PCR 混合產(chǎn)物，TE 緩沖液洗脫回收目標(biāo)DNA 片段。按照NEBNextUltraDNA Library Prep Kit for Illumina?標(biāo)準(zhǔn)流程進(jìn)行建庫(kù)操作。使用Illumina Hiseq2500 平臺(tái)對(duì)構(gòu)建的擴(kuò)增子文庫(kù)進(jìn)行PE250測(cè)序。利用Trimmomatic軟件對(duì)測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行Paired-end raw Reads 過(guò)濾，利用FLASH 對(duì)每對(duì)PE reads 進(jìn)行拼接，利用Mothur軟件進(jìn)行Raw Tags 序列質(zhì)量過(guò)濾，最終得到有效的拼接片段（Clean Tags）。

1.2.4 生物信息學(xué)分析 利用usearch 軟件（V10）對(duì)所有樣品的全部Clean Tags 進(jìn)行聚類(lèi)，默認(rèn)以97%的一致性將序列聚類(lèi)成為OTU（operational taxonomic units），對(duì)OTU 的具有代表性的序列進(jìn)行物種注釋?zhuān)⑦M(jìn)行Alpha 多樣性分析、Beta 多樣性分析及LEfSe 分析等。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 22.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，P＜0.05 認(rèn)為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。性別間差異采用卡方檢驗(yàn)，組間菌群相對(duì)豐度的差異采用Mann-Whitney 檢驗(yàn)，年齡間差異、OTU 數(shù)量及alpha 多樣性指數(shù)差異采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。LEfSe 分析首先使用多組比較的秩和檢驗(yàn)即Kruskal-WallisH檢驗(yàn)檢測(cè)不同分組間豐度差異顯著的物種，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義時(shí)進(jìn)行兩兩比較，最后用線性判別分析（LDA）來(lái)實(shí)現(xiàn)降維和評(píng)估差異顯著物種的影響大?。↙DA Score）。

2 結(jié)果

2.1 一般情況

本研究納入了ESCC 患者50 例，健康對(duì)照者40 例。均為漢族，其中ESCC 組男性44 例，女性6 例，健康對(duì)照組男性23 例，女性17 例。ESCC 年齡為（60.46±7.99）歲，健康對(duì)照組年齡（44.05±13.49）歲，兩組在年齡、性別組間比較均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05）。

2.2 OTU 構(gòu)建及物種分析

通過(guò)對(duì)所有樣品序列進(jìn)行拼接，質(zhì)控過(guò)濾掉低質(zhì)量序列后，ESCC 組和健康對(duì)照組的唾液樣本共獲得8 028 349條序列，平均每個(gè)樣本為89 204條。ESCC 組獲得序列平均為93 289 條，健康對(duì)照組獲得序列平均為84 098 條。以97%的一致性將序列聚類(lèi)為OUT，獲得平均OTU 分別為：ESCC 組633±264 和HC 組681±246。

我們對(duì)全部EffectiveTags 按照97%的序列相似性進(jìn)行OTU 聚類(lèi)，在phylum（門(mén)）和genus（屬）水平統(tǒng)計(jì)分析各樣本的群落組成。物種分析表明，經(jīng)門(mén)水平物種分析發(fā)現(xiàn)，兩組相對(duì)豐度≥1%的優(yōu)勢(shì)菌門(mén)的均為擬桿菌門(mén)（Bacteroidetes）、變形菌門(mén)（Proteobacteria）、厚壁菌門(mén)（Firmicutes）、梭桿菌門(mén)（Fusobacteria），雖然兩組的物種組成差異不大，但豐度比例卻不相同。ESCC 組與HC 組相比，厚壁菌門(mén)及梭桿菌門(mén)豐度比例升高，而擬桿菌門(mén)及變形菌門(mén)比例明顯降低（圖1）。

圖1 ESCC 組和HC 組在門(mén)水平的相對(duì)豐度柱形圖Fig.1 Bar charts of relative abundance of groups in phylum level between ESCC and HC

ESCC 組和HC 組相對(duì)豐度≥1%的優(yōu)勢(shì)菌屬相對(duì)豐度柱形圖見(jiàn)圖2。在屬水平，ESCC 組以奈瑟菌屬（Neisseria）、梭桿菌屬（Fusobacterium）、嗜血桿菌屬（Haemophilus）、普式菌屬（Prevotella）、卟啉單胞菌屬（Porphyromonas）為主，健康對(duì)照組以奈瑟菌屬（Neisseria）、嗜血桿菌屬（Haemophilus）、普式菌屬（Prevotella）、梭桿菌屬（Fusobacterium）、韋榮氏球菌屬（Veillonella）為主。

2.3 多樣性分析

圖2 ESCC 組和HC 組在屬水平的相對(duì)豐度柱形圖Fig.2 Bar charts of relative abundance of groups in genus level between ESCC and HC

Alpha 多樣性（Alpha diversity）是對(duì)單個(gè)樣品中物種多樣性的分析，通常計(jì)算的參數(shù)包括Observed_species 指數(shù)（觀測(cè)到的物種數(shù)）、Chao1指數(shù)、Shannon 指數(shù)、Simpson 指數(shù)以及PD whole tree 等。Chao1 和Observed_species 數(shù)值表示所測(cè)樣品中群落的豐富度，其值越高，則物種豐度越高，經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析兩組物種豐度差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。Shannon 指數(shù)、simpson 指數(shù)以及PD_whole_tree 值代表群落多樣性程度，其值越高，則多樣性越高，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（表1）。

Beta 多樣性（Beta Diversity）即樣品間的生物多樣性的比較，是對(duì)不同樣品間的微生物群落構(gòu)成進(jìn)行比較。統(tǒng)計(jì)所有OTU 在不同樣品中的相對(duì)豐度，之后利用Bray-Curtis 距離公式計(jì)算不同樣品間的間相異系數(shù)矩陣，對(duì)矩陣進(jìn)行層級(jí)聚類(lèi)及樣本距離heatmap 圖，顏色越紅表明樣本間距離越遠(yuǎn)，說(shuō)明兩組細(xì)菌群落構(gòu)成存在差異（圖3）。

2.4 LEfSe 分析

LEfSe 是一種用于發(fā)現(xiàn)高維生物標(biāo)識(shí)和揭示基因組特征的軟件分析，能夠在組與組之間尋找具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異的物種。LEfSe 分析得出兩組間有差異菌群共有25 種，其中普雷沃氏菌科、變形菌門(mén)、變形菌綱、嗜血桿菌屬等12 種菌在HC 組中富集（P＜0.05），另外包括卟啉單胞菌屬、紫單胞菌科、濱珊瑚屬、螺旋體屬等在內(nèi)的13 種菌在ESCC 組中顯著增高（P＜0.05；圖4）。

表1 ESCC 組和HC 組樣本α多樣性參數(shù)比較Table 1 Comparison of alpha diversity parameters between ESCC group and HC group

3 討論

圖3 樣本距離heatmap 圖Fig.3 The Heatmap between ECSS group and HC group

我國(guó)是世界上食管鱗癌高發(fā)國(guó)家，其中山西、廣東（潮汕）、河北、江蘇、四川、河南為6 個(gè)高發(fā)區(qū)［13］。早期食管癌根治術(shù)后預(yù)后良好，然而事實(shí)上食管癌病人就診時(shí)多處于中晚期，相當(dāng)多的病人已失去手術(shù)機(jī)會(huì)。因此提高食管癌早期診斷率和針對(duì)食管癌病因?qū)W的預(yù)防研究十分重要。目前，食管癌確切病因機(jī)制尚未清楚。而近年來(lái)有關(guān)微生態(tài)學(xué)即細(xì)菌在腫瘤發(fā)病中的作用已成為研究的熱點(diǎn)。2013 年Kostic 等［14］利用腸腫瘤形成小鼠模型和人類(lèi)結(jié)腸癌細(xì)胞，使用具核梭桿菌對(duì)腸腫瘤有遺傳易感性的小鼠進(jìn)行干預(yù)，發(fā)現(xiàn)比對(duì)照組形成了更多數(shù)量且更具侵襲性的腫瘤，證實(shí)具核梭桿菌誘導(dǎo)了促炎癥反應(yīng)和致癌活動(dòng)，在具核梭桿菌與腫瘤微環(huán)境的相互作用上，鑒別出了能夠誘導(dǎo)炎癥和腫瘤發(fā)生的細(xì)菌特異細(xì)胞表面的FadA 元件，結(jié)合結(jié)直腸癌細(xì)胞的E-cadherin，激活了細(xì)胞內(nèi)的β-catenin 信號(hào)，差異性調(diào)節(jié)了炎癥和致癌反應(yīng)，有利于結(jié)直腸癌的發(fā)展，促進(jìn)結(jié)直腸癌生長(zhǎng)。2012 年Farrell等［15］研究通過(guò)對(duì)胰腺癌患者和健康者的唾液微生物菌群比較，發(fā)現(xiàn)唾液菌群在胰腺癌中存在著顯著變化，表明唾液細(xì)菌學(xué)改變具有對(duì)胰腺癌預(yù)測(cè)診斷價(jià)值，2009 年Yang等［16］人研究發(fā)現(xiàn)不同疾病狀態(tài)下食管微生物菌群不同，以鏈球菌為主的正常食管和以革蘭氏陰性厭氧菌為主的食管炎和Barrett（BE）食管，而關(guān)于食管癌特別是鱗癌的特征性靶細(xì)菌學(xué)發(fā)現(xiàn)及該靶細(xì)菌的致癌機(jī)制尚未見(jiàn)。而在口腔中，無(wú)數(shù)的細(xì)菌形成一個(gè)復(fù)雜且穩(wěn)定的細(xì)菌群落，在口腔和全身疾病中起著重要作用［17-24］?？谇晃⑸镫S著唾液通過(guò)吞咽定植在消化道，由于食管細(xì)菌多來(lái)源于口腔，受唾液細(xì)菌影響較大，推測(cè)口腔細(xì)菌與食管癌發(fā)病也具有相關(guān)性。但有關(guān)唾液中細(xì)菌在食管癌預(yù)測(cè)中的價(jià)值及在食管癌發(fā)病中的作用和臨床意義研究至今國(guó)內(nèi)外未見(jiàn)報(bào)道。因此，我們使用16s rDNA 測(cè)序方法研究食管鱗癌患者唾液中的口腔微生物菌群，期望在食管鱗癌患者唾液中篩查出特異性表達(dá)的細(xì)菌，為食管鱗癌的早期篩查提供快速簡(jiǎn)單的方法。

在本研究中，α多樣性參數(shù)比較發(fā)現(xiàn)ESCC組和HC 組的Chao1 值和Ace 值沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，說(shuō)明ESCC 患者唾液菌群的整體含量并未發(fā)生明顯改變。Shannon 指數(shù)、simpson 指數(shù)以及PD_whole_tree 值差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，顯示兩組的菌群多樣性方面差異較小。Beta 多樣性樣本距離heatmap 圖提示兩組細(xì)菌群落構(gòu)成存在差異。物種分析表明與健康對(duì)照組相比，ESCC 組以奈瑟菌屬（Neisseria）、梭桿菌屬（Fusobacterium）、嗜血桿菌屬（Haemophilus）、普式菌屬（Prevotella）、卟啉單胞菌屬（Porphyromonas）為主，而LEfSe 分析表明ESCC 組卟啉單胞菌屬表達(dá)升高，且具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）。

本研究發(fā)現(xiàn)ESCC 患者的唾液菌群結(jié)構(gòu)與健康人不同，有其特征性的細(xì)菌組成，ESCC 組卟啉單胞菌屬相對(duì)于同組其他菌屬來(lái)講表達(dá)明顯升高，且具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。而卟啉單胞菌屬中牙齦卟啉單胞菌研究最熱。牙齦卟啉單胞菌（Porphyromonasgingivalis）認(rèn)為是牙周炎的致病菌［25-32］。既往多項(xiàng)研究表明牙齦卟啉單胞菌與食管癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。Gao 等［3］研究證明食管鱗狀細(xì)胞癌患者癌組織及癌旁正常組織發(fā)現(xiàn)牙齦卟啉單胞菌的感染，而健康對(duì)照組食管黏膜無(wú)感染；Peters 等［33］人使用16S rRNA 基因測(cè)序?qū)山M漱口水樣本進(jìn)行研究，結(jié)果表明牙齦卟啉單胞菌豐富者易患食管鱗癌，而福賽斯坦納菌與食管腺癌的高風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)，且牙齦卟啉單胞菌與食管鱗癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及短生存期有關(guān)。我們?cè)谶M(jìn)一步研究中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)部分食管癌組織內(nèi)牙齦卟啉單胞菌也升高，數(shù)據(jù)還在完善整理中，有關(guān)牙齦卟啉單胞菌的致癌機(jī)制也是下一步深入研究的課題。總之發(fā)現(xiàn)食管鱗癌口腔內(nèi)特異性的細(xì)菌，并研究它們的致癌機(jī)制，有可能為下一步食管鱗癌的預(yù)測(cè)診斷和預(yù)防發(fā)現(xiàn)到新的生物標(biāo)志物。