袁麗芳，楊俊華，邢志偉，祁方昉，左澤杰，姚志彬

（1.中山大學(xué)中山醫(yī)學(xué)院人體解剖學(xué)教研室，廣東廣州 510080；2.廣東藥科大學(xué)生命科學(xué)與生物制藥學(xué)院人體解剖學(xué)教研室，廣東廣州 510006）

鋁是地殼中含量最豐富的金屬元素之一［1］。日常生活中，人體可經(jīng)多種途徑接觸到鋁。人體長期攝入過多的鋁可在海馬等腦區(qū)內(nèi)蓄積，引起神經(jīng)炎癥［2］，持續(xù)性神經(jīng)炎癥可能引發(fā)神經(jīng)退行性疾病，如阿爾茲海默癥［3］和帕金森疾?。?］等。因此，鋁元素與神經(jīng)退行性疾病的關(guān)系備受關(guān)注。小鼠持續(xù)接觸過量的氯化鋁損害腦功能，引起記憶功能減退、膽堿能神經(jīng)元丟失等，這些損害被認(rèn)為與鋁元素在腦內(nèi)蓄積后誘發(fā)的炎癥反應(yīng)有關(guān)［5］。文獻認(rèn)為Iba-1+/CD68+表型的促炎型小膠質(zhì)細胞是腦損害的細胞學(xué)指標(biāo)［6］，當(dāng)海馬出現(xiàn)炎癥時，Iba-1+/CD68+細胞數(shù)量增加。局部促炎因子白介素-1β（interleukin-1β，IL-1β）和腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）的表達增加是炎癥反應(yīng)的重要分子水平事件［7］。海馬內(nèi)小膠質(zhì)細胞促炎型激活以及促炎因子的高表達會引發(fā)認(rèn)知、情緒、神經(jīng)發(fā)生等多方面神經(jīng)行為學(xué)損害，這種損害與腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子（brain derived neurotrophic factor，BDNF）表達的降低有關(guān)［8］。益生菌是一類能有效調(diào)節(jié)腸道菌群的活性微生物。臨床上常用以乳桿菌和雙歧桿菌為代表的益生菌改善腸道菌群失調(diào)，從而改善患者的健康狀況。研究顯示，益生菌可通過腸-腦軸調(diào)節(jié)腦的功能［9］。在抑郁小鼠模型［10］和抗生素應(yīng)用造成菌群失調(diào)以及海馬神經(jīng)發(fā)生與認(rèn)知功能受損的［11］小鼠模型中，口服益生菌被證實能改善腸道菌群失衡并恢復(fù)海馬組織的神經(jīng)發(fā)生，從而對大腦認(rèn)知功能等產(chǎn)生重要的有益影響。這些發(fā)現(xiàn)提示益生菌具有改善腦內(nèi)神經(jīng)炎癥的作用，但未見明確的報道。本實驗研究口服益生菌可能改善鋁暴露誘發(fā)的海馬神經(jīng)炎癥，為益生菌在鋁暴露高風(fēng)險人群海馬炎癥的預(yù)防中的應(yīng)用提供有力的基礎(chǔ)研究依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物和飼養(yǎng)

C57BL/6 小鼠購自廣東省實驗動物中心［許可證號：SYXK（粵）2019-0209］。實驗動物飼養(yǎng)于SPF 環(huán)境：溫度（22±2）℃，濕度（55±5）%，12 h 光照和12 h 黑暗條件，食物和水自由獲取。本研究所有動物實驗操作程序獲得中山大學(xué)實驗動物倫理委員會機構(gòu)審批并通過。

1.2 氯化鋁和益生菌處理過程

合生元益生菌沖劑（廣州市合生元生物制品有限公司）每包1.5 g 含有1.9×108cfu/g 雙歧桿菌（B.bifidum 和B.infantis）和6.4×109cfu/g 乳桿菌。本實驗將8 周齡雄性小鼠隨機分成4 組，分別為對照（CON）組、氯化鋁處理（Al）組、益生菌處理（PO）組和聯(lián)合處理（Al+PO）組，分別持續(xù)給予無菌水、按體質(zhì)量100 mg/kg 給予口服氯化鋁、給予含益生菌的水（15 g/L）以及按體質(zhì)量100 mg/kg 給予口服氯化鋁并同時給予含益生菌的水（15 g/L），共持續(xù)6 周。

1.3 免疫熒光染色法

小鼠按體質(zhì)量10 mL/kg 經(jīng)腹腔注射40 g/L 水合氯醛麻醉，每組各3 只，共12 只小鼠，剪開胸腔，暴露心臟，剪開右心房，左心室插管灌注生理鹽水，待流出液清后轉(zhuǎn)4 ℃含40 g/L 多聚甲醛（paraformaldehyde，PFA）的磷酸緩沖液灌注以固定，快速剝?nèi)〈竽X并浸泡在40 g/L PFA 中后固定24 h，梯度脫水后行連續(xù)冰凍切片（厚度40 μm）。

Iba-1+/CD68+雙標(biāo)染色：將腦組織冰凍切片經(jīng)磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer，PBS）洗后，用含2 g/L Triton X-100的牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）于37 ℃孵育30 min，加入一抗：大鼠抗-CD68（1∶1 000）、羊抗-Iba-1（1∶1 000），于37 ℃孵育2 h 后放入4 ℃孵育過夜，次日用PBS 漂洗3次后加入二抗：Alexa Fluor 488-驢抗大鼠-IgG（1∶500）、Alexa Fluor 594-驢抗羊-IgG（1∶500），于37 ℃孵育2 h，PBS 漂洗3 次后用熒光封片劑（0.01 mol/L PBS 和甘油1∶1）封片。

BDNF 單標(biāo)染色：按照Iba-1+/CD68+雙標(biāo)染色進行封閉，加入一抗：兔抗-BDNF（1∶1 000），于37 ℃孵育2 h 后放入4 ℃孵育過夜，次日用PBS 漂洗3 次后加入二抗：Alexa Fluor 595-驢抗兔-IgG（1∶500），于37 ℃孵育2 h，PBS 漂洗3 次后用熒光封片劑封片。

封片完畢后于激光共聚焦顯微鏡下掃描拍照。應(yīng)用Image J 圖像分析軟件對Iba-1+/CD68+和BDNF 的熒光強度值進行測量，計算其平均值作為最終的平均免疫熒光強度。

1.4 酶聯(lián)免疫吸附試驗

采用商品化酶聯(lián)免疫吸附（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）試劑盒檢測血清和海馬組織IL-1β、TNF-α的表達量。小鼠按體質(zhì)量10 mL/kg 經(jīng)腹腔注射40 g/L 水合氯醛麻醉，每組各3 只，共12 只小鼠，經(jīng)眼球取血后，剪開胸腔，暴露心臟，剪開右心房，左心室插管灌注生理鹽水，待流出液清后迅速剝?nèi)〈竽X海馬組織并于冰上進行勻漿。血液樣品于室溫靜置40 min，于冰上靜置2 h，待析出血清后于4 ℃，1 000 ×g離心10 min。將已包被單抗的酶標(biāo)板室溫下平衡30 min，梯度濃度稀釋標(biāo)準(zhǔn)品，將血清或海馬組織勻漿于冰上做相應(yīng)稀釋，在空白孔加標(biāo)準(zhǔn)品和標(biāo)本通用稀釋液（100 μL/孔），其余孔加樣品或梯度標(biāo)準(zhǔn)品（100 μL/孔），2 個復(fù)孔/樣，于37 ℃孵育1.5 h，洗板5 次后，在空白孔加生物素化抗體稀釋液（100 μL/孔），其余孔中加生物素化抗體工作液（100 μL/孔），于37 ℃孵育1 h，洗板5 次，空白孔中加入酶結(jié)合物稀釋液（100 μL/孔），余孔加酶結(jié)合物工作液（100 μL/孔），于37 ℃避光孵育30 min，洗板5 次，加入顯色底物（100 μL/孔），混勻后立即于波長450 nm 測出各孔的光密度（optical density，OD）值，根據(jù)梯度濃度的標(biāo)準(zhǔn)品以及對應(yīng)的OD 值做出標(biāo)準(zhǔn)曲線，將樣品OD 值一次帶入方程，計算對應(yīng)的濃度。

1.5 統(tǒng)計學(xué)分析

所有數(shù)據(jù)采用SPSS 25.0 統(tǒng)計軟件進行分析。經(jīng)檢驗，所有數(shù)據(jù)已通過組內(nèi)正態(tài)分布檢驗。其中，血清中TNF-α含量數(shù)據(jù)組間方差不齊，采用H 檢驗（Kruskal-WallisHtest）進行分析，數(shù)據(jù)以中位數(shù)和四分位數(shù)描述，即用P50（P25～P75）在論文中進行表示；其余數(shù)據(jù)均通過組間方差齊性檢驗，采用雙因素方差分析，數(shù)據(jù)以均值±標(biāo)準(zhǔn)差在論文中進行表示。兩兩比較采用LSD 法，α=0.05 為顯著性水準(zhǔn)。

2 結(jié)果

2.1 口服益生菌減少海馬組織中被激活的小膠質(zhì)細胞數(shù)量

在14 周齡，本研究通過免疫熒光染色檢測小鼠海馬組織中的Iba-1+/CD68+細胞數(shù)量，雙因素方差分析結(jié)果顯示：氯化鋁處理的主效應(yīng)差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=268.09，P＜0.01）；益生菌處理的主效應(yīng)差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=49.56，P＜0.01）；氯化鋁聯(lián)合益生菌處理的主效應(yīng)差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=71.47，P＜0.01）。組間兩兩比較顯示：與CON 組相比，Al 組海馬組織中Iba-1+/CD68+細胞數(shù)量顯著增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（3 221±207vs.5 672±232，P＜0.01）；與Al 組相比，Al+PO 組海馬組織中Iba-1+/CD68+細胞數(shù)量顯著減少，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（5 672±232vs.4 142±127，P＜0.01）；與CON 組相比，PO 組海馬組織中Iba-1+/CD68+細胞數(shù)量無顯著改變，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（3 221±207vs.3 360±67，P=0.35；圖1）。

2.2 口服益生菌減少血清及海馬組織中IL-1β和TNF-α的含量

在14 周齡，我們通過ELISA 檢測小鼠血清和海馬組織中IL-1β和TNF-α含量。小鼠海馬組織中的IL-1β含量采用雙因素方差分析，結(jié)果顯示：氯化鋁處理的主效應(yīng)差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=356.35，P＜0.01）；益生菌處理的主效應(yīng)差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=116.36，P＜0.01）；氯化鋁聯(lián)合益生菌處理的主效應(yīng)差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=106.67，P＜0.01）。組間兩兩比較顯示：與CON 組相比，Al組海馬組織中IL-1β含量顯著增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（17±0.86vs.34±1.1，P＜0.01）；與Al 組相比，Al+PO 組海馬組織中IL-1β含量顯著減少，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（34±1.1vs.22±1.3，P＜0.01）；與CON 組相比，PO 組海馬組織中IL-1β含量無顯著改變，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（17±0.86vs.17±0.57，P=0.75；圖2A）。小鼠海馬組織中TNF-α含量采用雙因素方差分析，結(jié)果顯示：氯化鋁處理的主效應(yīng)差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=53.97，P＜0.01）；益生菌處理的主效應(yīng)差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=17.92，P=0.003）；氯化鋁聯(lián)合益生菌處理的主效應(yīng)差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=21.80，P=0.002）。組間兩兩比較顯示：與CON 組相比，Al 組海馬組織中TNF-α含量顯著增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（7.3±0.86vs.14±1.3，P＜0.01）；與Al 組相比，Al+PO 組海馬組織中TNF-α含量顯著減少，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（14±1.3vs.9.0±0.7，P＜0.01）；與CON 組相比，PO組海馬組織中TNF-α含量無顯著改變，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（7.3±0.86vs.7.6±0.61，P=0.77；圖2B）。

圖1 口服益生菌減少海馬組織中被激活的小膠質(zhì)細胞數(shù)量Fig.1 Oral probiotic administration reduced the number of Iba-1+/CD68+cells in hippocampus

小鼠血清中IL-1β含量采用雙因素方差分析，結(jié)果顯示：氯化鋁處理的主效應(yīng)差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=186.39，P＜0.01）；益生菌處理的主效應(yīng)差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=53.67，P＜0.01）；氯化鋁聯(lián)合益生菌處理的主效應(yīng)差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=60.37，P＜0.01）。組間兩兩比較顯示：與CON組相比，Al 組血清中IL-1β含量顯著增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（25±1.7vs.57±4.4，P＜0.01）；與Al 組相比，Al+PO 組血清中IL-1β含量顯著減少，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（57±4.4vs.35±1.7，P＜0.01）；與CON 組相比，PO 組血清中IL-1β含量無明顯改變，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（25±1.7vs.26±1.4，P=0.76；圖2C）。血清中TNF-α含量采用H檢驗，H=9.359，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.025）。組間兩兩比較顯示：與CON 組相比，Al 組血清中TNF-α含量顯著增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義［28.3（25.8～29.7）vs.132.2（129.8～138.6），P=0.009］；與Al 組相比，Al+PO 組血清中TNF-α含量顯著減少，差異無統(tǒng)計學(xué)意義［132.2（129.8～138.6）vs.57.2（56.3～57.7），P=0.308］；與CON 組相比，PO 組血清中TNF-α含量無顯著改變，差異無統(tǒng)計學(xué)意義［28.3（25.8～29.7）vs.27.1（26.2～29.6），P=0.91；圖2D］。

2.3 口服益生菌增加海馬組織中BDNF的表達量

在14 周齡，本研究通過免疫熒光染色法檢測海馬組織中BDNF 的表達量，雙因素方差分析結(jié)果顯示：氯化鋁處理的主效應(yīng)差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=92.12，P＜0.01；益生菌處理的主效應(yīng)差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=8.44，P=0.02）；氯化鋁聯(lián)合益生菌處理的主效應(yīng)差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=18.50，P=0.003）。組間兩兩比較顯示：與CON 組相比，Al 組海馬組織中BDNF 表達量顯著減少，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（43±3.2vs.21±2.0，P＜0.01）；與Al 組相比，Al+PO 組海馬組織中BDNF 表達量顯著增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（21±2.0vs.32±3.1，P=0.01）；與CON 組相比，PO 組海馬組織中BDNF 表達量無明顯改變，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（43±3.2vs.41±2.8，P=0.35；圖3）。

圖2 口服益生菌減少血清及海馬組織中IL-1β和TNF-α的含量Fig.2 Oral probiotic administration reduced the levels of IL-1β and TNF-α in serum and hippocampus

圖3 口服益生菌增加海馬組織中BDNF 的表達量Fig.3 Oral probiotic administration increased the expression of BDNF in hippocampus

3 討論

研究表明，包括認(rèn)知功能障礙［12］、阿爾茲海默癥［3］和帕金森疾?。?］在內(nèi)的許多神經(jīng)退行性疾病都與鋁元素密切相關(guān)。日常生活中，我們通過許多途徑可以接觸到鋁元素，如飲用水、油炸面制品和鋁制炊具中鋁的溶出等。人體長期接觸鋁元素會導(dǎo)致大腦中鋁元素的蓄積，引起神經(jīng)炎癥［2］，如表現(xiàn)為海馬組織中膠質(zhì)細胞活化，從而增加了許多神經(jīng)退行性疾病的發(fā)病可能［13］。持續(xù)性的中樞神經(jīng)系統(tǒng)炎癥是神經(jīng)退行性疾病的發(fā)病機制之一。文獻［6］報道，大腦海馬炎癥與腦內(nèi)被激活的小膠質(zhì)細胞（Iba-1+/CD68+）有關(guān)，并且Iba-1+和CD68+被認(rèn)為是促炎反應(yīng)發(fā)生的重要指標(biāo)［14］。本文免疫熒光法檢測結(jié)果顯示：攝入過多的鋁導(dǎo)致海馬組織中Iba-1+/CD68+細胞數(shù)量顯著增加，而口服益生菌則顯著減少了海馬組織中Iba-1+/CD68+細胞數(shù)量。既往研究表明，局部促炎因子IL-1β和TNF-α 的表達增加是炎癥反應(yīng)的重要分子水平事件［7］，BDNF 在大腦功能方面發(fā)揮著重要作用，缺乏BDNF 已被證實會導(dǎo)致嚙齒類動物海馬神經(jīng)發(fā)生下降和行為學(xué)損害等異常表現(xiàn)［8］。本文結(jié)果顯示：攝入過多的鋁導(dǎo)致海馬組織中IL-1β和TNF-α的含量顯著增加，而BDNF 表達量顯著減少，口服益生菌顯著減少了海馬組織中IL-1β和TNF-α的含量并增加了BDNF 表達量。本研究的發(fā)現(xiàn)證明了口服益生菌改善鋁誘發(fā)的小鼠海馬炎癥，提示口服益生菌可能對降低許多神經(jīng)退行性疾病的發(fā)病風(fēng)險有一定的作用。

近年來，益生菌對人體產(chǎn)生的有益作用受到了廣泛的關(guān)注。許多研究表明，益生菌通過腸-腦軸參與調(diào)節(jié)大腦功能和行為［15］。Mohle［11］報道在抗生素處理小鼠模型中，口服益生菌通過重構(gòu)腸道菌群影響了免疫細胞，從而恢復(fù)了大腦海馬組織的神經(jīng)發(fā)生。但口服益生能否有效干預(yù)鋁誘導(dǎo)的神經(jīng)炎癥尚不清楚。

本研究旨在探索益生菌對鋁元素誘導(dǎo)的海馬神經(jīng)炎癥是否具有保護作用。我們根據(jù)文獻對鋁暴露的海馬炎癥小鼠模型進行驗證性檢測，鋁暴露組與對照組相比呈現(xiàn)小膠質(zhì)細胞促炎型激活和海馬內(nèi)促炎因子升高，確定了造模成功。聯(lián)合組與鋁暴露組的各指標(biāo)差異，有力地支持了本研究的科學(xué)假設(shè)，即口服益生菌確實能減輕鋁元素誘導(dǎo)的海馬神經(jīng)炎癥。

值得注意的是，本研究中的單純益生菌處理組與對照組相比，各檢測指標(biāo)無明顯改變，這一結(jié)果也與相關(guān)文獻報道一致［11］。這種現(xiàn)象說明，益生菌的神經(jīng)保護效應(yīng)在已有病理狀態(tài)下才顯著。因此，就人類而言，某些疾病的患者口服益生菌可能比健康人口服益生菌會得到更顯著的神經(jīng)保護作用。誠然，這一推斷尚需深入的基礎(chǔ)與臨床研究加以證實。

綜上所述，本文證明口服益生菌改善了鋁誘導(dǎo)的海馬神經(jīng)炎癥，除小膠質(zhì)細胞炎性改變外，還可觀察到海馬內(nèi)增加BDNF 的表達量和降低IL-1β、TNF-α的含量。本研究進一步證明了益生菌對人體的有益作用。鑒于益生菌的安全性已毫無疑問，本研究的結(jié)果提示口服益生菌或可在臨床上作為有效的非藥物干預(yù)手段，以預(yù)防鋁誘導(dǎo)的神經(jīng)毒性作用。