楊 帆 楊 艷 王曉亮 孫 薇 陳 軍

(空軍軍醫(yī)大學(xué)唐都醫(yī)院疼痛生物醫(yī)學(xué)研究所，西安 710038)

腺相關(guān)病毒(adeno-associated virus，AAV)是一類無包被，直徑約為22 nm 的單鏈DNA 病毒。它是一種非致病病毒。由于，其自身的安全性和低免疫原性且可持續(xù)表達(dá)的特性已成為神經(jīng)系統(tǒng)研究和基因治療的重要工具之一[1-4]。目前，已發(fā)現(xiàn)100多種腺相關(guān)病毒，由于組成衣殼蛋白在空間構(gòu)象及序列上的差異，導(dǎo)致其對不同的細(xì)胞或組織具有不同的轉(zhuǎn)導(dǎo)效能[5]。已有研究發(fā)現(xiàn)[6]，AAV8 基因型最顯著的特點(diǎn)是轉(zhuǎn)導(dǎo)肝臟組織，同時(shí)也可轉(zhuǎn)導(dǎo)大腦神經(jīng)元及背根神經(jīng)節(jié)(DRG)。AAV4對肺的選擇特異性高[7]。AAV1和AAV7在骨骼肌細(xì)胞轉(zhuǎn)導(dǎo)快速且表達(dá)量很高，AAV1、AAV4和AAV5對中樞神經(jīng)系統(tǒng)靶向性明顯；AAV2對腎臟具有高的選擇性；AAV8對心臟和胰腺轉(zhuǎn)導(dǎo)效能優(yōu)異[8]。在腺相關(guān)病毒載體對外周神經(jīng)系統(tǒng)的研究中，Storek等[9]通過鞘內(nèi)給藥方式給予雄性SD大鼠攜帶抗傷害性疼痛基因的腺相關(guān)病毒(AAV1和AAV8)載體，發(fā)現(xiàn)AAV8在轉(zhuǎn)染DRG神經(jīng)元的效果最佳。Mason等[10]在雌性Wistar大鼠采用DRG直接注射的方式，比較了不同血清型腺相關(guān)病毒(AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6和AAV8)載體對初級感覺神經(jīng)元的轉(zhuǎn)染效果，發(fā)現(xiàn)AAV5的轉(zhuǎn)染效果最佳。由此可見，由于不同實(shí)驗(yàn)動物品系以及給藥方式的差異，腺相關(guān)病毒載體對DRG神經(jīng)元的轉(zhuǎn)導(dǎo)效能也存在著不同。因此，為了更加精確地了解腺相關(guān)病毒載體對雄性SD大鼠DRG神經(jīng)元的轉(zhuǎn)導(dǎo)效能，我們利用免疫熒光技術(shù)對4種不同血清型腺相關(guān)病毒(AAV5、AAV6、AAV8和AAV9)載體對DRG神經(jīng)元的轉(zhuǎn)導(dǎo)效能與表達(dá)進(jìn)行了比較，發(fā)現(xiàn)AAV9對雄性SD大鼠DRG神經(jīng)元的轉(zhuǎn)導(dǎo)效能最佳。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

腺相關(guān)病毒(AAV5、AAV6、AAV8和AAV9)載體購自漢恒生物技術(shù)有限公司。24只雄性SD大鼠(180～200 g)，購自空軍軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心，實(shí)驗(yàn)動物生產(chǎn)許可證號：SCXK(陜)2019-001。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1分組：SD大鼠隨機(jī)分為8組，每組3只，分別通過DRG直接注射的方式給予腺相關(guān)病毒(AAV5、AAV6、AAV8和AAV9)載體。飼養(yǎng)期間保持動物自由飲食和飲水，晝夜交替間隔12 h。

1.2.2DRG注射腺相關(guān)病毒載體：將實(shí)驗(yàn)動物用1%戊巴比妥鈉(60 mg/kg)麻醉后，沿大鼠背部中線位置切開，用咬骨剪，剪去脊柱部分椎板，暴露左側(cè)L3、L4、L5的 DRG，用微量注射器扎入DRG中心位置，等待3 min以便針尖部位組織恢復(fù)到封閉狀態(tài)，然后注入AAV溶液10 μL，注射完畢等待1～2 min后再拔出微量注射器，防止腺相關(guān)病毒載體滲出，依次注射暴露的DRG，之后逐層縫合大鼠傷口。

1.2.3組織切片的熒光分析：將注射3周和4周后的大鼠用1%戊巴比妥鈉(60 mg/kg)腹腔麻醉，預(yù)冷生理鹽水和4%多聚甲醛依次行主動脈灌注，灌流結(jié)束后取出左側(cè)L3、L4和L5的DRG，置于4%多聚甲醛中固定，隨后經(jīng)15%和30%蔗糖溶液梯度脫水直至組織完全沉糖，液氮速凍。用OCT包埋后冰凍切片機(jī)切片(12 μm)，并逐一貼片于掛膠載玻片上，將玻片置于避光環(huán)境自然風(fēng)干后，0.01%的PBS漂洗3次，10 min/次，再次避光自然風(fēng)干使用抗熒光淬滅劑封片。在Olympus-FV1000共聚焦顯微鏡下進(jìn)行拍片，選用Image J 圖像分析系統(tǒng)計(jì)算熒光強(qiáng)度。每組3只大鼠，每只大鼠的L3、L4和L5 DRG分別取5～8張連續(xù)切片。

2 結(jié)果

2.1 4種不同血清型AAV病毒在大鼠DRG神經(jīng)元轉(zhuǎn)染結(jié)果比較

組織切片熒光結(jié)果顯示：注射后3周，AAV5對DRG神經(jīng)元幾乎無轉(zhuǎn)染，AAV6和AAV8對DRG神經(jīng)元均略有轉(zhuǎn)染， AAV9的轉(zhuǎn)染效果最好(圖1、表1)。注射后4周，AAV5、AAV6及AAV8對DRG神經(jīng)元的轉(zhuǎn)染效果相似，AAV9對DRG神經(jīng)元的轉(zhuǎn)染效果最佳，神經(jīng)元和纖維束均清晰可見(圖2、表1)。

圖1 DRG直接注射不同血清型的AAV病毒(AAV5、AAV6、AAV8和AAV9)3周后神經(jīng)元綠色熒光蛋白的表達(dá)及定量注：A.DRG切片免疫熒光示例圖表明AAV9對神經(jīng)元的轉(zhuǎn)染效率最高；B.平均兔疫熒光強(qiáng)度定量表明AAV9對神經(jīng)元的轉(zhuǎn)染強(qiáng)度最高Fig.1 GFP expression and quantification in sections of DRG 3 weeks after injected with vectors based on AAV serotypes 5,6,8 and 9Note:A.Representative immunofluorescence sections show that AAV9 has the highest transduction rate.B.Quantification of the mean immunofluorescent intensity shows that AAV9 has the highest transduction intensity

表1 不同血清型AAV病毒在大鼠DRG神經(jīng)元轉(zhuǎn)染效果Table 1 The transfection effect of different AAV serotypes in rat DRG neurons

圖2 DRG直接注射不同血清型的AAV病毒以(AAV5、AAV6、AAV8和AAV9)4周后神經(jīng)元綠色熒光蛋白的表達(dá)及定量注：A.DRG切片免疫熒光示例圖表明AAV9對神經(jīng)元的轉(zhuǎn)染效率最高；B.平均兔疫熒光強(qiáng)度定量表明AAV9對神經(jīng)元的轉(zhuǎn)染強(qiáng)度最高Fig.2 GFP expression and quantification in sections of DRG 4 weeks after injected with vectors based on AAV serotypes 5,6,8 and 9Note:A.Representative immunofluorescence sections show that AAV9 has the highest transduction rate.B.Quantification of the mean immunofluorescent intensity shows that AAV9 has the highest transduction intensity

2.2 同種血清型AAV病毒不同時(shí)間在大鼠DRG神經(jīng)元轉(zhuǎn)染結(jié)果比較

為了對比AAV病毒轉(zhuǎn)染的時(shí)程與效果間的關(guān)系，本研究對同種血清型AAV病毒分別轉(zhuǎn)染3 周和4 周的平均熒光強(qiáng)度進(jìn)行分析比較。如圖3所示：病毒注射第4周相較于注射第3周，AAV5的轉(zhuǎn)染效果(平均熒光強(qiáng)度)明顯增高，AAV6的轉(zhuǎn)染效果未見明顯變化，AAV8的轉(zhuǎn)染效果明顯增強(qiáng)，AAV9對DRG神經(jīng)元的轉(zhuǎn)染效率顯著提高。

圖3 DRG直接注射不同血清型的AAV病毒(AAV5、AAV6、AAV8和AAV9)3周和4周后神經(jīng)元綠色熒光強(qiáng)度對比Fig.3 The comparison of the mean immunofluorescent intensity between 3 and 4 weeks in sections of DRG after inected with vectors based on AAV serotypes 5,6,8 and 9

綜上所述，對雄性SD大鼠DRG直接注射不同血清型腺相關(guān)病毒(AAV5、AAV6、AAV8和AAV9)載體3 周和4 周后，AAV9對大鼠DRG神經(jīng)元的轉(zhuǎn)染效能最佳。

3 討論

腺相關(guān)病毒載體具有較高的安全性、低免疫原性、可持續(xù)表達(dá)等特性，已成為神經(jīng)系統(tǒng)研究以及基因治療的重要工具之一。但由于衣殼蛋白在空間構(gòu)象及蛋白序列存在差異，因此不同血清型腺相關(guān)病毒載體在不同生物種系的組織和細(xì)胞的轉(zhuǎn)導(dǎo)效能上存在差異。Storek等[9]通過鞘內(nèi)給藥方式，給予雄性SD大鼠攜帶抗傷害性疼痛基因的腺相關(guān)病毒(AAV1和AAV8)載體，發(fā)現(xiàn)AAV8對DRG神經(jīng)元的轉(zhuǎn)導(dǎo)效能最佳；而Mason[10]實(shí)驗(yàn)室在雌性Wistar大鼠上用DRG直接注射的方式，比較了不同血清型的腺相關(guān)病毒(AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6和AAV8)載體對DRG初級感覺神經(jīng)元的轉(zhuǎn)導(dǎo)效能，發(fā)現(xiàn)AAV5的轉(zhuǎn)導(dǎo)效能最佳。在本研究中，我們通過給雄性SD大鼠的DRG直接注射不同血清型腺相關(guān)病毒(AAV5、AAV6、AAV8和AAV9)載體，發(fā)現(xiàn)AAV9對DRG初級感覺神經(jīng)元的轉(zhuǎn)染效能最佳。

綜上所述，我們發(fā)現(xiàn)AAV9對雄性SD大鼠DRG神經(jīng)元的轉(zhuǎn)導(dǎo)效能最佳，為后續(xù)外周神經(jīng)系統(tǒng)的研究以及臨床基因治療提供了有力證據(jù)。