王學文 劉佐民 王勁松 李永清

(1. 中國食品藥品檢定研究院實驗動物資源研究所，北京 102629)(2. 北京市農(nóng)林科學院畜牧獸醫(yī)研究所，北京 100097)

流行性感冒簡稱流感，是一種由甲型流感病毒引起的急性呼吸道傳染病。甲型流感病毒可以引起人和多種動物感染發(fā)病。由于流感病毒具有高突變率和高變異性，病毒的不斷變異[1-3]往往導致疾病的大暴發(fā)與大流行，給人類的健康乃至生命安全構成了嚴重威脅，經(jīng)濟發(fā)展造成了重大損失。另外，抗流感病毒藥物的研發(fā)是流感防治的重要目標，然而該病毒的這種高突變率與高變異性為抗病毒藥物的研發(fā)帶來很大困難，抗流感病毒藥物研發(fā)是流感防治研究的重要目標之一。

中藥是我國醫(yī)藥的寶貴資源，從古到今在防治流感疾病方面發(fā)揮了重大的作用，不僅對流感病毒有直接殺傷作用，還能調(diào)動機體特異性和非特異性免疫功能來增強抗病毒能力。由蒲公英、百部、白薇、白術等多味中藥組成的復方中藥是北京洪天力藥業(yè)有限公司提供的臨床經(jīng)驗方，該復方中藥具有解熱鎮(zhèn)痛、抗病毒、抗感染、抗氧化和調(diào)節(jié)免疫功能等作用[4-7]。前期對該復方中藥抗流感病毒作用進行了研究，證實了該中藥具有體外多環(huán)節(jié)抗流感病毒作用[8]，體內(nèi)具有抑制流感病毒在肺內(nèi)增殖，減輕流感病毒造成的肺損傷的功效[9]。但有關該藥對流感病毒感染后免疫功能的影響尚不明確，因此，本實驗以流感病毒A/PR/8/34(H1N1)滴鼻。感染小鼠造模，進一步觀察免疫器官指數(shù)，T、B淋巴細胞轉(zhuǎn)化率和肺組織中的細胞因子水平，以期進一步明確復方中藥抗流感病毒作用，探索作用機理，為該復方中藥的臨床應用提供更多理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1實驗動物：SPF級BALB/c小鼠，雌性90只，6～8周齡，18～22 g，由北京大學醫(yī)學部實驗動物科學部提供，實驗動物生產(chǎn)許可證號：SCXK(京)2016-0010。飼養(yǎng)于北京市農(nóng)林科學院畜牧獸醫(yī)研究所隔離器中，實驗動物實驗許可證號：SYXK(京)2017-0039。環(huán)境參數(shù)：溫度(25±1)℃，相對濕度(55±15)%，壓差≥50 Pa，潔凈度5級，明暗交替12 h/12 h。適應性喂養(yǎng)5 d后開始進入正式實驗。實驗福利倫理審查號：20150316-3。實驗期間，根據(jù)實驗動物使用的3R原則給予人道關懷。

1.1.2病毒:H1N1鼠肺適應株全稱流感病毒A/PR/8/34(H1N1)，簡稱流感病毒PR8，由中國農(nóng)業(yè)大學劉金華老師饋贈。經(jīng)雞胚傳代增殖2輪，過濾后，-80 ℃保存?zhèn)溆?。?jīng)測定LD50為10-3.375/50 μL。

1.2 試劑及儀器

復方中藥(北京洪天力藥業(yè)有限公司提供的臨床經(jīng)驗方)；鹽酸金剛烷胺、刀豆蛋白(ConA)、脂多糖(LPS)、淋巴細胞分離液Histopaque 1083、RPMI 1640 培養(yǎng)基、四甲基偶氮唑鹽(MTT)(Sigma公司)；小鼠IL-6、IL-10、TNF-α和IFN-γ酶聯(lián)免疫試劑盒(Ebioscience公司)。

CO2培養(yǎng)箱HF151(上海力申科學儀器有限公司)；酶標儀Model 550(Bio-Rad公司)；生物安全柜BHC-1300IIA2(蘇州安泰空氣技術有限公司)；-80 ℃冰箱DW-HL828(中科美菱低溫科技有限責任公司)；超純水系統(tǒng)Milli-Q Integral(Millipore公司)。

1.3 方法

1.3.1實驗動物分組及流感病毒模型的建立：將90只雌性BALB/c小鼠，適應性喂養(yǎng)5 d。稱量記錄后隨機分為6組：空白對照組，模型對照組，鹽酸金剛烷胺對照組，復方中藥高、中、低劑量組，每組15只，5只/籠。分組及給藥劑量見表1。按人和小鼠劑量關系[10]轉(zhuǎn)換成復方中藥中劑量組劑量為0.75 g/kg，并以中劑量的2倍作為復方中藥高劑量組劑量，中劑量的1/2作為復方中藥低劑量組劑量。試驗前用100 ℃去離子水進行稀釋配制，復方中藥制劑高、中、低劑量濃度分別為75 mg/mL，37.5 mg/mL和18.8 mg/mL。

表1 實驗動物分組Table 1 The group of experimental animals

復方中藥組灌胃2 d后，空白對照組小鼠滴鼻生理鹽水50 μL/只，其他各組攻毒流感病毒PR8 10LD50/50 μL。病毒感染4 h后，中藥各組灌胃給藥，連續(xù)灌胃5 d，1次/d，0.2 mL/10 g?？瞻讓φ战M和模型對照組灌胃給予去離子水，鹽酸金剛烷胺組灌胃10 mg/mL鹽酸金剛烷胺，灌胃體積、時間和方式同中藥三個劑量組。

1.3.2復方中藥對流感病毒PR8感染BALB/c小鼠脾臟指數(shù)和胸腺指數(shù)的測定流感病毒PR8感染BALB/c小鼠5 d后，小鼠禁食不禁水12 h后，稱體質(zhì)量，無菌取血。然后頸椎脫臼處死，摘取胸腺和脾臟并稱質(zhì)量，按下列公式計算胸腺指數(shù)和脾臟指數(shù)：

脾臟指數(shù)=(小鼠脾質(zhì)量/小鼠體質(zhì)量)×100%

胸腺指數(shù)=(小鼠胸腺質(zhì)量/小鼠體質(zhì)量)×100%

1.3.3復方中藥對流感病毒PR8感染BALB/c小鼠T、B淋巴細胞增殖的測定：流感病毒PR8感染BALB/c小鼠5 d后的小鼠無菌取外周血于肝素鈉潤濕的2 mL離心管中，加入PBS混勻后，將混勻后的血樣輕輕加到淋巴細胞分離液的液面上。2 000 r/min離心20 min，小心吸取分離液和PBS之間的白色霧狀細胞至新的試管中，即為外周血單核細胞。沉淀再用1 mL 1640完全營養(yǎng)液重懸，制得淋巴細胞懸液。臺盼藍染色，顯微鏡計數(shù)其中的活細胞數(shù)，調(diào)整至2×106個/mL。細胞懸液內(nèi)一份加入ConA，每孔100 μL，每組4個重復，ConA最終濃度為5 μg/mL，用于測定T淋巴細胞轉(zhuǎn)化率；另一份加入LPS，每孔100 μL，每組4個重復，調(diào)整LPS最終濃度為10 μg/mL，用于測定B淋巴細胞轉(zhuǎn)化率。細胞板置于37 ℃ 5%CO2培養(yǎng)箱2 d后，加入5 mg/mL 20 μL，MTT，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后取出，置于超凈工作臺上，加150 μL，DMSO震蕩溶解10 min，用酶標儀A570讀數(shù)。以各樣本A值表示T、B淋巴細胞的增殖能力[11]。

1.3.4復方中藥對流感病毒PR8感染BALB/c小鼠肺組織中細胞因子水平的測定：流感病毒PR8感染BALB/c小鼠5 d后，小鼠禁食不禁水12 h后處死，打開胸腔并摘取全肺，用生理鹽水沖洗干凈，再用濾紙吸干水分，電子天平稱質(zhì)量。分別取肺臟置勻漿器中加冷生理鹽水，肺臟質(zhì)量與生理鹽水體積比為1∶9，在冰浴中研磨制成勻漿，4 ℃離心后取上清準備檢測細胞因子。IL-6、IL-10、TNF-α和IFN-γ細胞因子測定方法均是采用雙抗夾心法測定，操作嚴格按照試劑盒說明書要求進行。

1.4 統(tǒng)計方法

2 結果

2.1 復方中藥對流感病毒PR8感染BALB/c小鼠脾臟指數(shù)和胸腺指數(shù)的影響

流感病毒PR8感染BALB/c小鼠后，與空白對照組相比，模型對照組脾臟指數(shù)和胸腺指數(shù)顯著降低 (P<0.01)。采用復方中藥和鹽酸金剛烷胺治療后，與模型對照組相比，復方中藥中劑量組胸腺指數(shù)顯著升高 (P<0.01)，復方中藥中劑量組脾臟指數(shù)顯著升高(P<0.05)；其他組脾臟指數(shù)和胸腺指數(shù)也都有所增高，但無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；復方中藥高、中、低劑量組的脾臟指數(shù)和胸腺指數(shù)兩兩比較無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。結果見表2。

表2 復方中藥對PR8感染BALB/c小鼠脾臟指數(shù)和胸腺指數(shù)的影響Table 2 Influence of compound traditional Chinese medicine on the spleen index and thymus index of PR8 infected BALB/c mice

2.2 復方中藥對流感病毒PR8感染BALB/c小鼠的T、B淋巴細胞增殖的影響

流感病毒PR8感染小鼠后，與空白對照組比較，模型對照組T、B淋巴細胞A值顯著降低(P<0.01)；經(jīng)藥物治療后，與模型對照組相比，復方中藥中劑量組T、B淋巴細胞A值顯著增高(P<0.05)，其他組T、B淋巴細胞A值均有不同程度的增高，但無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；復方中藥高、中、低劑量組之間的T、B淋巴細胞A值兩兩比較無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。結果見表3。

表3 復方中藥對PR8感染小鼠T、B淋巴細胞增殖的影響Table 3 Influence of compound traditional Chinese medicine on multiplication of T and B lymphocytes in PR8 infected mice

2.3 復方中藥對流感病毒PR8感染BALB/c小鼠肺組織中細胞因子水平的影響結果

2.3.1復方中藥對流感病毒PR8感染BALB/c小鼠肺組織中TNF-α和IL-6含量的影響

流感病毒感染小鼠5 d后，與空白對照組相比，模型對照組TNF-α和IL-6顯著升高(P<0.01)；與模型對照組相比，復方中藥中劑量組和復方中藥低劑量組TNF-α顯著降低 (P<0.01)，復方中藥中劑量組IL-6顯著降低 (P<0.05)，其他組均有不同程度的降低，但無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；復方中藥高、中、低劑量組的TNF-α和IL-6含量兩兩比較無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。結果見表4。

表4 復方中藥對PR8感染BALB/c小鼠肺組織中TNF-α和IL-6含量的影響Table 4 Impact of compound traditional Chinese medicine on lung tissue TNF-α和IL-6 concent in PR8 infected BALB/c mice

2.3.2復方中藥對流感病毒PR8感染BALB/c小鼠肺組織中IL-10含量的影響：模型對照組與空白對照組相比，IL-10顯著降低(P<0.01)；與模型對照組相比，灌胃給藥后，復方中藥中劑量組IL-10顯著升高 (P<0.05)，其他組均有不同程度的升高，但是沒有統(tǒng)計學意義(P>0.05)；復方中藥高、中、低劑量組的IL-10含量兩兩比較無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。結果見表5。

表5 復方中藥對PR8感染BALB/c小鼠肺組織中IL-10含量的影響Table 5 Impact of compound traditional Chinese medicine on lung tissue IL-10 concent in PR8 infected BALB/c mice

2.3.3復方中藥對PR8感染BALB/c小鼠肺組織中IFN-γ含量的影響：與空白對照組相比，模型對照組IFN-γ顯著降低(P<0.01)；與模型對照組相比，復方中藥中、低劑量組IFN-γ顯著升高(P<0.01)，復方中藥高劑量組IFN-γ顯著升高(P<0.05)；復方中藥高、中、低劑量組的IFN-γ含量兩兩比較無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。結果見表6。

表6 復方中藥對PR8感染BALB/c小鼠肺組織中IFN-γ含量的影響Table 6 Impact of compound traditional Chinese medicine on lung tissue IFN-γ concent in PR8 infected BALB/c mice

3 討論

脾臟是機體識別異物，促進免疫細胞分化增殖，進而發(fā)生免疫應答的場所；脾臟指數(shù)能夠反映機體免疫細胞分化增殖能力。胸腺是T淋巴細胞的發(fā)生成熟的場所，流感病毒能通過樹突狀細胞從肺轉(zhuǎn)移到胸腺并干擾 T 淋巴細胞的合成[12]，胸腺指數(shù)能初步反映機體的免疫狀況。 實驗中流感病毒PR8感染BALB/c小鼠5 d后，與空白對照組相比，模型對照組小鼠脾臟指數(shù)和胸腺指數(shù)顯著降低，進一步證明小鼠流感病毒感染模型建立成功。各組小鼠連續(xù)灌胃藥物7 d后，與模型對照組相比，復方中藥中劑量組小鼠胸腺指數(shù)和脾臟指數(shù)顯著升高，原因有可能是復方中藥中劑量組的小鼠病毒感染后引起免疫應答，引起胸腺和脾臟內(nèi)部結構的變化，抑制其免疫器官的萎縮。其他藥物組小鼠脾臟指數(shù)和胸腺指數(shù)均有不同程度的升高，但無統(tǒng)計學意義，可能是其引起的免疫應答不足以抑制PR8感染小鼠的免疫器官胸腺和脾臟發(fā)生內(nèi)部結構變化。

淋巴細胞增殖實驗是檢測機體免疫功能的常用指標，淋巴細胞增殖能力高低反應細胞免疫和體液免疫水平的變化。T淋巴細胞和B淋巴細胞都是特異性免疫的主要細胞，ConA體外可誘導T淋巴細胞增殖，LPS能誘導B淋巴細胞的增殖。由實驗結果可見，流感病毒PR8感染BALB/c小鼠5 d后，與空白對照組相比，模型對照組小鼠的T、B淋巴細胞A值均顯著降低，表明流感病毒可以明顯抑制小鼠淋巴細胞增殖，抑制了機體免疫功能；小鼠攻毒后繼續(xù)灌胃藥物5 d后，與模型對照組相比，復方中藥中劑量組小鼠T、B淋巴細胞顯著升高，表明復方中藥中劑量組可改善小鼠細胞功能，提高機體的免疫能力。而其他藥物組T、B淋巴細胞A值均有不同程度的升高，但無統(tǒng)計學意義，表明可能其不足以改善小鼠細胞功能，提高機體的免疫能力。

機體感染流感病毒可引起肺部間質(zhì)性肺炎，對肺部造成一定損傷，生成一些超出生理濃度的細胞因子，過多的細胞因子導致內(nèi)皮細胞活化，白細胞遷移和毛細血管的滲漏等，增加對腎臟毒性，嚴重的可以引起心腎衰竭，引起死亡[13-14]。細胞因子按功能可以分為促炎因子與抗炎因子兩類。復方中藥治療病毒感染性疾病并不是單純抗病毒，還可以抑制或調(diào)節(jié)機體炎癥免疫病理反應[15-16]。因為肺臟是流感病毒的靶器官，本實驗測定小鼠連續(xù)灌胃藥物5 d后肺組織勻漿中的細胞因子，可更直接反應藥物調(diào)節(jié)細胞因子分泌改變機體的炎癥損傷的狀態(tài)。

TNF-α是重要的炎癥促進因子，被認為是前炎癥因子的關鍵因子，可以控制后來的前炎癥細胞因子如IL-6的產(chǎn)生。當TNF-α的濃度升高時，可以介導炎性反應的許多病變過程，比如引起局部炎性反應，造成器官甚至系統(tǒng)的損害。IL-6是一種小分子糖蛋白，也是一種重要的促炎性因子。二者均為致炎因子，它們是構成免疫性病理損害的重要因素[17]，阻斷二者的過量產(chǎn)生，可以減輕或清除其對器官的損傷。本實驗研究結果顯示，流感病毒PR8感染BALB/c小鼠5 d后，肺組織中TNF-α和IL-6均明顯高于空白對照組，說明病毒感染可引起機體免疫功能紊亂，通過引起TNF-α及IL-6的大量釋放，造成肺部炎癥損傷。經(jīng)復方中藥干預治療后，與模型對照組相比，復方中藥中劑量組小鼠肺組織中IL-6和TNF-α顯著降低；復方中藥低劑量組小鼠肺組織中TNF-α顯著降低。表明復方中藥能調(diào)節(jié)機體免疫功能，使機體對病毒產(chǎn)生了免疫應答，并將其進行清除，從而減輕小鼠感染流感病毒過程中降低炎性因子的表達，減少了局部或全身的炎癥損傷。

伴隨著炎性細胞因子的趨化、活化和釋放，機體同時會分泌炎癥抑制因子對其進行反向調(diào)節(jié)。IL-10近些年來受到大量關注，針對炎癥反應的調(diào)節(jié)起著非常重要的作用[18]。該研究結果發(fā)現(xiàn)BALB/c小鼠感染流感病毒后IL-10明顯降低，表明流感病毒可以導致機體抗炎性細胞因子IL-10的表達降低?？赡苡捎诩毦虿《疚皆诤粑鲤つけ砻婊蛏掀ぜ毎?，直接造成損害，影響細胞因子的產(chǎn)生和釋放，致使其分泌水平的下降，這與胡旭[19]報道一致。經(jīng)復方中藥干預治療后，各組小鼠肺組織IL-10基因的表達相對模型對照組均有不同程度的增加，且復方中藥中劑量組IL-10顯著升高，表明了復方中藥能明顯上調(diào)流感病毒感染小鼠過程中肺組織中抗炎因子IL-10的表達。

IFN-γ是一種廣泛的抗病毒物質(zhì)，有著廣泛的免疫調(diào)節(jié)作用的抗病毒物質(zhì)，幾乎對所有病毒都有一定程度的抑制作用，被認為是抑制宿主病毒感染的第一道防線[20]。本研究結果顯示流感病毒PR8感染小鼠后，肺組織中IFN-γ的含量明顯降低，說明流感病毒PR8感染BALB/c小鼠后，可抑制其免疫調(diào)節(jié)功能，降低抗病毒能力。經(jīng)復方中藥干預治療后，復方中藥中、低劑量組IFN-γ含量均明顯升高，都具有統(tǒng)計學意義，表明復方中藥具有免疫調(diào)節(jié)和抗病毒，清除病原體等作用。

此外，實驗結果表明復方中藥中劑量調(diào)節(jié)細胞因子分泌能力優(yōu)于復方中藥高劑量組和復方中藥低劑量組，這有可能是復方中藥高劑量組本身對機體產(chǎn)生一定的副作用，復方中藥低劑量組藥物有效濃度不夠，不能顯著調(diào)節(jié)細胞因子分子。與模型對照組相比，鹽酸金剛烷胺在降低促炎性因子TNF-α和IL-6，提高抗炎性因子IL-10和提高抗病毒因子IFN-γ方面，均無統(tǒng)計學意義，說明鹽酸金剛烷胺并不是通過調(diào)節(jié)細胞因子分泌的途徑來抑制流感病毒的增殖。

復方中藥可以減輕免疫器官脾臟和胸腺萎縮程度，通過改善流感感染小鼠的T細胞免疫和B淋巴細胞體液免疫功能，調(diào)節(jié)細胞因子濃度來發(fā)揮其抗病毒作用。然而復方中藥抗流感病毒作用是否還存在其他作用機制還有待進一步證實。