高元喜 張 煒 王玉霞 嚴(yán)佳麗 劉新宇

(1. 宜昌市中醫(yī)醫(yī)院腫瘤科，宜昌 443000)(2. 武漢科技大學(xué)附屬醫(yī)學(xué)腫瘤科，武漢 430064)

食管癌發(fā)生于人消化道，是一種在世界范圍內(nèi)常見、惡性程度高、極具侵襲性、極難治療的惡性腫瘤之一[1]。近年來在我國的發(fā)病率逐漸上升，2017年全國范圍內(nèi)其發(fā)病率及死亡率在所有癌癥中位居前五[2]。由于食管癌患者早期癥狀不明顯，不易被發(fā)現(xiàn)，因此大部分患者被確診時(shí)已是中晚期。而且癌細(xì)胞易發(fā)生早期遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，且極易復(fù)發(fā)，即使通過手術(shù)切除原發(fā)腫瘤以及常規(guī)化療方法治療，預(yù)后效果仍然不佳，嚴(yán)重降低了患者生存質(zhì)量[3-4]。因此篩選出高效且毒副作用小的抗食管癌藥物意義重大。目前，食管癌的化療通常以順鉑等鉑類藥物為基礎(chǔ)藥物，輔以5-氟尿嘧啶(5-FU)[5]、多西他賽[6]、紫杉醇[7]等。但由于癌細(xì)胞會(huì)對(duì)這些藥物產(chǎn)生耐藥性，使其治療率和緩解率大幅下降。南蛇藤醇是從南蛇藤(CelastrusorbiculatusThunb.)中提取出來的一種甲醇提取物質(zhì)，具有多種生物學(xué)特性，包括抗腫瘤，抗炎，鎮(zhèn)痛，抗生育，抗菌和抗病毒特性[8]。有相關(guān)報(bào)道稱，南蛇藤的某些成分可有效的抗腫瘤轉(zhuǎn)移[9]、增殖[10]、侵襲[11]、抑制EMT[12]、誘導(dǎo)癌細(xì)胞發(fā)生凋亡[13]等。目前仍缺少關(guān)于南蛇藤醇對(duì)食管癌作用的研究報(bào)道，因此本研究通過南蛇藤醇聯(lián)合順鉑處理食管癌細(xì)胞EC109，探索南蛇藤醇介導(dǎo)的PTEN過表達(dá)對(duì)食管癌腫瘤生長、癌細(xì)胞存活、侵襲、EMT以及凋亡的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

選用36只4周齡SPF級(jí)BALB/c雌性裸鼠，體質(zhì)量18～22 g，購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK(京)2019-0009。

1.2 主要儀器

Olympus BX53 M顯微鏡 (日本Olympus公司)，高速低溫離心機(jī) (美國Beckman公司)，OLYMPLUSIX73熒光顯微鏡 (日本 Olympus公司)，AMA440 N高壓滅菌鍋 (英國Astell公司)，電泳槽、電轉(zhuǎn)儀 (美國Bio-Rad公司)，凝膠成像系統(tǒng)GDS-800 UVP (美國UVP公司)。

1.3 藥品與試劑

食管癌EC109細(xì)胞、人食管上皮細(xì)胞系HET-1 A(中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫)，RPMI-1640培養(yǎng)基(HyClone)，南蛇藤醇(廣州軍區(qū)藥品儀器檢驗(yàn)所)，順鉑(Sigma)，PTEN、Ki67、PCNA、E-cadherin、N-cadherin、Vimentin、cleaved PARP、cleaved caspase 3抗體(美國NEB 公司)，HRP標(biāo)記的山羊抗小鼠二抗 (美國Santa Cruz 公司)；蛋白Marker、Fermentas、EDTA 緩沖液(pH 8.0)(美國Sigma 公司)，PVDF膜(美國BD公司)，Hoechst染色試劑盒、RIPA強(qiáng)裂解液(上海碧云天生物技術(shù)有限公司)。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1細(xì)胞培養(yǎng)：EC109、DDP細(xì)胞在補(bǔ)充有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中生長。所有細(xì)胞均在含有5%CO2的培養(yǎng)箱中37 ℃培養(yǎng)。細(xì)胞匯合率達(dá)到85%以上時(shí)用0.25%胰酶進(jìn)行消化傳代。

1.4.2動(dòng)物模型建立與藥物干預(yù):將食管癌細(xì)胞EC109/DDP(5×109/L)于裸鼠一側(cè)腹股溝部皮下注射到小鼠體內(nèi)。腹腔注射PBS或南蛇藤醇或順鉑(5 mg/kg)至荷瘤小鼠體內(nèi)。將其分為四組：EC109/DDP+PBS，EC109/DDP+順鉑， EC109/DDP+順鉑+南蛇藤醇組(1 mg/kg)，EC109/DDP+順鉑+南蛇藤醇組(5 mg/kg)。每組9只。每隔5 d測量腫瘤體積，30 d后處死裸鼠，剝離移植瘤，測量其質(zhì)量并計(jì)算腫瘤生長抑制率。腫瘤生長抑制率(%)=(EC109/DDP+PBS組平均瘤質(zhì)量-藥物組平均瘤質(zhì)量)/(EC109/DDP+PBS組平均瘤質(zhì)量)×100%。

1.4.3免疫組化:采用鏈霉親和素-生物素-復(fù)合過氧化物酶試劑盒對(duì)腫瘤組織中Ki67、caspase-3、VEGE進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色。Image-Pro Plus 圖像分析系統(tǒng)上對(duì)異種移植物的免疫染色進(jìn)行分析。

1.4.4CCK8分析檢測細(xì)胞存活率：將對(duì)數(shù)生長期的EC109、HET-1 A細(xì)胞傳代培養(yǎng)于96孔板中，培養(yǎng)24 h后用不同劑量的南蛇藤醇(0.5、1、2.5、5、10、20、50、80和100 μmol/L)處理人食管上皮細(xì)胞系(HET-1 A)24 h，根據(jù)試劑盒說明書每孔加入10 μL CCK8試劑并于培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育2 h，用酶標(biāo)儀檢測各組吸光度，繪制折線圖并計(jì)算細(xì)胞生長速度 (增殖倍數(shù)=細(xì)胞吸光度/0 h 細(xì)胞吸光度)。選取對(duì)正常細(xì)胞影響不大的南蛇藤醇濃度 (1、2.5和5 μmol/L) 用作后續(xù)實(shí)驗(yàn)。順鉑(4 μg/mL)預(yù)處理EC109/DDP細(xì)胞后分別用不同劑量的南蛇藤醇處理EC109/DDP細(xì)胞，對(duì)照組用PBS代替順鉑，將其分為五組：對(duì)照組，順鉑(4 μg/mL)組，順鉑+南蛇藤醇(1 μmol/L)組，順鉑+南蛇藤醇(2.5 μmol/L)組，順鉑+南蛇藤醇(5 μmol/L)組，CCK8試劑盒檢測細(xì)胞存活率。

1.4.5免疫印跡法：使用裂解緩沖液裂解細(xì)胞樣品。然后，使用BCA蛋白質(zhì)測定試劑盒定量蛋白質(zhì)濃度。含有20 mg蛋白質(zhì)的樣品在10%SDS-PAGE中分離，然后轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯膜上。用5% 脫脂牛奶室溫封閉蛋白2 h，隨后加入一抗于4 ℃封閉過夜，第二天加入對(duì)應(yīng)二抗室溫封閉1 h，最后滴加ECL,設(shè)置曝光參數(shù)，檢測目的條帶對(duì)應(yīng)化學(xué)發(fā)光強(qiáng)弱。

1.4.6Transwell：順鉑(4 μg/mL)預(yù)處理EC109/DDP細(xì)胞后，分別用不同劑量的南蛇藤醇處理EC109/DDP細(xì)胞，對(duì)照組用PBS代替順鉑。將處理過的細(xì)胞消化離心，無血清培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，以 1×104孔的細(xì)胞數(shù)量種入上室，下室加入有血清的培養(yǎng)基。48 h后用無菌棉簽擦去小室上層細(xì)胞，將 transwell 小室倒置風(fēng)干，并放入含有 500 μL 染色液(0.1%結(jié)晶紫)的12孔板中，染色 20 min，取出后在 PBS 中清洗3次，并風(fēng)干。在transwell小室直徑上取5個(gè)視野，在顯微鏡下拍照計(jì)數(shù)。

1.4.7Hoechst染色檢測調(diào)亡：按1.4.6使用藥物處理細(xì)胞，將處理后的細(xì)胞用預(yù)冷的PBS洗滌2次，每次5 min。細(xì)胞在4 ℃下于 4%多聚甲醛中固定1 h。然后每孔加入1 mL Hoechst 33258熒光染料，然后棄去染色液，在暗處用PBS洗滌2次，每次5 min。用熒光顯微鏡觀察細(xì)胞并拍照。細(xì)胞的核濃縮和分裂被用作細(xì)胞凋亡的指標(biāo)。

1.5 統(tǒng)計(jì)方法

2 結(jié)果

2.1 南蛇藤醇增強(qiáng)順鉑對(duì)體內(nèi)腫瘤形成的抑制作用

如圖1A所示，與EC109/DDP+PBS組比較，EC109/DDP+順鉑+南蛇藤醇(1 mg/kg)和EC109/DDP+順鉑+南蛇藤醇(5 mg/kg)組腫瘤質(zhì)量均顯著降低(P<0.05)。順鉑(5 mg/kg)組的腫瘤生長抑制率為3.84%，EC109/DDP+順鉑+南蛇藤醇(1 mg/kg)的腫瘤生長抑制率為25.64%，EC109/DDP+順鉑+南蛇藤醇(5 mg/kg)組的腫瘤生長抑制率為53.84%；如圖1B所示，與EC109/DDP+PBS組比較，在南蛇藤醇處理后25～30 d，EC109/DDP+順鉑+南蛇藤醇(1 mg/kg)和EC109/DDP+順鉑+南蛇藤醇(5 mg/kg)組腫瘤體積顯著減小(P<0.05)。如圖1C所示，與EC109/DDP+PBS組比較，EC109/DDP+順鉑+南蛇藤醇(1 mg/kg)和EC109/DDP+順鉑+南蛇藤醇(5 mg/kg)組PTEN蛋白表達(dá)水平顯著升高(P<0.05)。如圖1D所示，與EC109/DDP+PBS組比較，EC109/DDP+順鉑+南蛇藤醇(1 mg/kg)和EC109/DDP+順鉑+南蛇藤醇(5 mg/kg)組Ki67，VEGF和Caspase 3陽性細(xì)胞數(shù)均顯著減少(P<0.05)。

圖1 南蛇藤醇對(duì)體內(nèi)腫瘤形成的作用注： 與EC109/DDP+PBS組比較，*P<0.05，**P<0.01Fig.1 Effect of methanol extract of Cel.orbiculatus on tumor formation in vivoNote: Compared with the EC109/DDP+PBS group，*P<0.05，**P<0.01

2.2 南蛇藤醇增強(qiáng)順鉑對(duì)食管癌細(xì)胞EC109生長的抑制作用

如圖2A 所示，HET-1A細(xì)胞存活率以南蛇藤醇濃度依賴的方式降低，當(dāng)MIL濃度超過20 μmol/L時(shí)，HET-1A細(xì)胞存活率顯著降低(P<0.05)。與對(duì)照組比較，順鉑+南蛇藤醇(1 μmol/L)組、順鉑+南蛇藤醇(2.5 μmol/L)組和順鉑+南蛇藤醇(5 μmol/L)組EC109細(xì)胞存活率均顯著降低(P<0.05)。如圖2B所示，與對(duì)照組比較，順鉑+南蛇藤醇(1 μmol/L)組、順鉑+南蛇藤醇(2.5 μmol/L)組和順鉑+南蛇藤醇(5 μmol/L)組Ki67和PCNA蛋白表達(dá)水平顯著降低(P<0.05)。

圖2 南蛇藤醇增強(qiáng)順鉑對(duì)食管癌細(xì)胞EC109生長的抑制作用注：與對(duì)照組比較,*P<0.05Fig.2 Methanol extract of Cel. orbiculatus enhanced the inhibitory effect of cisplatin on EC109 growth of esophageal carcinoma cellsNote: Compared with the control group,*P<0.05

2.3 南蛇藤醇增強(qiáng)順鉑對(duì)食管癌細(xì)胞EC109侵襲和EMT的抑制作用

如圖3A所示，與對(duì)照組比較，順鉑+南蛇藤醇(1 μmol/L)組、順鉑+南蛇藤醇(2.5 μmol/L)組和順鉑+南蛇藤醇(5 μmol/L)組的侵襲細(xì)胞數(shù)均顯著減少(P<0.05)。如圖3B所示，與對(duì)照組比較，順鉑+南蛇藤醇(1 μmol/L)組、順鉑+南蛇藤醇(2.5 μmol/L)組和順鉑+南蛇藤醇(5 μmol/L)組E-cadherin蛋白表達(dá)水平均顯著升高(P<0.05)，N-cadherin和Vimentin蛋白表達(dá)水平均顯著降低(P<0.05)。

圖3 南蛇藤醇增強(qiáng)順鉑對(duì)食管癌細(xì)胞EC109侵襲和EMT的抑制作用注：與對(duì)照組比較,*P<0.05Fig.3 Methanol extract of Cel. orbiculatus enhanced the inhibitory effect of cisplatin on EC109 invasion and EMT of esophageal carcinoma cellsNote: Compared with the control group,*P<0.05

2.4 南蛇藤醇促進(jìn)順鉑誘導(dǎo)的食管癌細(xì)胞EC109凋亡

如圖4A所示，與對(duì)照組比較，順鉑+南蛇藤醇(1 μmol/L)組、順鉑+南蛇藤醇(2.5 μmol/L)組和順鉑+南蛇藤醇(5 μmol/L)組凋亡細(xì)胞數(shù)均顯著增加(P<0.05)。如圖4B所示，與對(duì)照組比較，順鉑+南蛇藤醇(1 μmol/L)組、順鉑+南蛇藤醇(2.5 μmol/L)組和順鉑+南蛇藤醇(5 μmol/L)組cleaved PARP和cleaved caspase 3蛋白表達(dá)水平均顯著升高(P<0.05)。

圖4 南蛇藤醇對(duì)順鉑誘導(dǎo)的食管癌細(xì)胞EC109凋亡的影響注：與對(duì)照組比較,*P<0.05Fig.4 Methanol extract of Cel.orbiculatus enhanced the inhibitory effect of cisplatin on EC109 invasion and EMT of esophageal carcinoma cellsNote: Compared with the control group, *P<0.05

2.5 干擾PTEN促進(jìn)食管癌細(xì)胞生長和侵襲

如圖5A所示，與對(duì)照組比較，順鉑+南蛇藤醇(1 μmol/L)組、順鉑+南蛇藤醇(2.5 μmol/L)組和順鉑+南蛇藤醇(5 μmol/L)組PTEN蛋白表達(dá)水平均顯著增加(P<0.05)。如圖5B所示，與南蛇藤醇(5 μmol/L)組比較，南蛇藤醇+sh-PTEN組PTEN蛋白表達(dá)水平均顯著降低(P<0.05)；南蛇藤醇+sh-PTEN組細(xì)胞存活率和侵襲細(xì)胞數(shù)均顯著升高(P<0.05)，凋亡細(xì)胞數(shù)顯著減少(P<0.05)。

圖5 干擾PTEN對(duì)食管癌細(xì)胞存活率、侵襲力以及凋亡的影響注： 與對(duì)照組比較,*P<0.05Fig.5 Effect of interfering pten on survival rate, invasiveness and apoptosis of esophageal carcinoma cellsNote: Compared with the control group,*P<0.05

3 討論

食管癌在我國的致死率逐年上升，對(duì)人類健康造成嚴(yán)重影響[14-15]。由于食管癌患者早期癥狀不明顯，患者確診時(shí)多是癌癥中晚期，所以臨床上一般對(duì)其采用手術(shù)治療以及放抗癌藥物和化療結(jié)合的方式進(jìn)行治療。但仍存在后期易復(fù)發(fā)、易轉(zhuǎn)移、易產(chǎn)生耐藥性、化療藥物的毒副作用大等問題[16]。因此，許多研究開始探索藥物聯(lián)合治療來解決這些問題。目前，研究報(bào)道稱南蛇藤提取物在胃腺癌[9]、肝癌[13]、膠質(zhì)母細(xì)胞瘤[11]等治療方面有很好的功效。目前關(guān)于南蛇藤醇對(duì)食管癌的功效還缺少報(bào)道，因此，本研究探索南蛇藤醇介導(dǎo)的PTEN過表達(dá)對(duì)食管癌的作用。

癌細(xì)胞無限增殖是癌癥發(fā)生發(fā)展的重要機(jī)制。研究發(fā)現(xiàn)在體內(nèi)，南蛇藤醇可明顯降低實(shí)體瘤的體積和重量，且不良反應(yīng)低，抑制Hepa1-6細(xì)胞的增殖，并在mRNA和蛋白水平上抑制VEGF的表達(dá)，降低了腫瘤血管生成[17]。同樣，Jin等[18]研究發(fā)現(xiàn)南蛇藤醇以時(shí)間和劑量依賴性方式降低食管鱗癌細(xì)胞的存活率，并且通過PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路抑制增殖。與前人研究結(jié)果一致，本研究發(fā)現(xiàn)南蛇藤醇處理后的食管癌腫瘤模型小鼠體內(nèi)腫瘤重量和體積均降低，Ki67、VEGF和Caspase 3陽性細(xì)胞數(shù)均減少，EC109細(xì)胞存活率降低以及Ki67和PCNA蛋白表達(dá)水平降低，PTEN蛋白表達(dá)水平升高，而當(dāng)干擾PTEN后，PTEN蛋白表達(dá)水平降低，細(xì)胞存活率降低，表明南蛇藤醇介導(dǎo)的PTEN的過表達(dá)可增強(qiáng)順鉑對(duì)體內(nèi)腫瘤形成和食管癌細(xì)胞EC109生長的抑制作用。

上皮細(xì)胞-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化在癌癥轉(zhuǎn)移中有重要作用，是上皮細(xì)胞極性喪失、惡性腫瘤細(xì)胞獲得遷移和侵襲能力的一個(gè)重要生物學(xué)過程[19]。研究發(fā)現(xiàn)南蛇藤醇可明顯抑制AGS細(xì)胞的侵襲，南蛇藤醇處理后E-cadherin蛋白表達(dá)升高， N-cadherin和Vimentin蛋白表達(dá)降低，從而抑制上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化過程[20]。目前在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的研究中發(fā)現(xiàn)南蛇藤醇處理增加E-cadherin的表達(dá)，降低N-cadherin和vimentin的表達(dá)，抑制EMT的過程和膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞的侵襲[21]。本研究發(fā)現(xiàn)南蛇藤醇處理后侵襲細(xì)胞數(shù)明顯減少，E-cadherin蛋白表達(dá)水平升高，N-cadherin和Vimentin蛋白表達(dá)水平均降低，然而干擾PTEN后，PTEN蛋白表達(dá)水平下調(diào)，侵襲力降低，表明南蛇藤醇介導(dǎo)的PTEN的過表達(dá)可增強(qiáng)順鉑對(duì)食管癌細(xì)胞EC109侵襲和EMT的抑制作用。

誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡是抑制腫瘤生長的主要手段之一。南蛇藤醇觸發(fā)線粒體介導(dǎo)的凋亡途徑并激活caspase-3，抑制Bcl-2和Bcl-xL蛋白的表達(dá)水平，并上調(diào)了Bax和caspase-3的表達(dá)水平，從而促進(jìn)細(xì)胞凋亡[10]。研究發(fā)現(xiàn)南蛇藤醇處理后Bcl-2與Bax表達(dá)比值的降低，線粒體膜電位升高，南蛇藤醇可促進(jìn)食管鱗癌細(xì)胞EC109凋亡。本研究發(fā)現(xiàn)南蛇藤醇處理后凋亡細(xì)胞數(shù)明顯增加，以及凋亡相關(guān)蛋白cleaved PARP和cleaved caspase 3蛋白表達(dá)水平升高，而干擾PTEN后，PTEN蛋白表達(dá)水平降低，凋亡率明顯下降，表明南蛇藤醇介導(dǎo)的PTEN過表達(dá)可促進(jìn)順鉑誘導(dǎo)的食管癌細(xì)胞EC109凋亡。

綜上所述，南蛇藤醇介導(dǎo)的PTEN過表達(dá)可有效的抑制腫瘤生長、降低腫瘤細(xì)胞存活率、促進(jìn)食管癌細(xì)胞凋亡、降低侵襲能力、抑制EMT過程的發(fā)生，增強(qiáng)順鉑對(duì)食管癌細(xì)胞的化學(xué)敏感性，表明南蛇藤醇治療可有效抑制食管癌的發(fā)展，且毒副作用較小，為南蛇藤醇應(yīng)用于食管癌防治提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。