張宇飛 宋俊伯 危冬昱 龍 盤 李曼紅 高錦成 周 健 陳 濤 張作明

(1. 空軍軍醫(yī)大學(xué)航空航天臨床醫(yī)學(xué)中心，西安 710032)(2. 空軍軍醫(yī)大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，西安 710032)(3. 中國人民解放軍西部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院眼科，成都 610083)(4. 空軍軍醫(yī)大學(xué)第一附屬醫(yī)院西京醫(yī)院眼科，西安 710032)(5. 陜西省中醫(yī)醫(yī)院，西安 710082)

脈絡(luò)膜新生血管(choroidal neovascularization，CNV)相關(guān)疾病是目前眼科領(lǐng)域內(nèi)主要的致盲性疾病之一，主要以病理性增殖性新生血管形成為特征，易患人群十分廣泛，是目前亞洲地區(qū)甚至發(fā)達(dá)國家致視力損傷的主要疾病之一[1-3]。目前臨床上對CNV相關(guān)疾病的治療還缺乏較為有效的方法，主要采用抗VEGF治療、激光光凝、光動力治療、經(jīng)瞳孔溫?zé)岑煼ǖ葘ΠY緩解治療[4-7]。隨著國內(nèi)外中醫(yī)藥研究的發(fā)展，發(fā)現(xiàn)越來越多的中醫(yī)藥在許多難以攻克的疾病上有著良好的治療效果[8]，已有研究表明許多中藥對CNV相關(guān)疾病也有著一定的療效[9]。和血明目片作為眼科常用的中成藥之一，被廣泛用于臨床治療糖尿病視網(wǎng)膜病變、高血壓眼底出血和年齡相關(guān)性黃斑變性等眼科血管性疾病[10-11]。但是，目前尚缺乏相關(guān)動物實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)及相應(yīng)機(jī)制研究證據(jù)。因此，本實(shí)驗(yàn)旨在從動物實(shí)驗(yàn)角度出發(fā)研究和血明目片對CNV 的治療效果，為下一步開展機(jī)制研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物

健康8周齡雄性C57BL/6小鼠30只，空軍軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供，實(shí)驗(yàn)動物使用許可證號：SYXK(軍)2017-0045，實(shí)驗(yàn)動物生產(chǎn)許可證號：SCXK(軍)2017-0021，SPF級環(huán)境下常規(guī)飼養(yǎng)，提供充足飲食，明暗交替12 h /12 h。實(shí)驗(yàn)動物的飼養(yǎng)和使用符合視覺與眼科研究協(xié)會制定的科研動物使用規(guī)范。

1.2 藥物與試劑

和血明目片(西安碑林藥業(yè)股份有限公司)；戊巴比妥鈉、FITC標(biāo)記凝集素(美國Sigma公司)；陸眠寧(吉林省華牧動物保健品有限公司)；熒光素鈉注射液(廣州白云山明興制藥有限公司)；復(fù)方托吡卡胺滴眼液、加替沙星眼用凝膠(沈陽興齊眼藥股份有限公司)；鹽酸奧布卡因滴眼液(參天制藥有限公司)。

1.3 主要儀器

視覺電生理檢查儀(德國羅蘭)；同步共焦激光眼底熒光造影儀(德國海德堡)；577 nm倍頻Nd：YAG 激光器(美國科醫(yī)人)。

1.4 方法

1.4.1動物分組：動物適應(yīng)3 d后進(jìn)行隨機(jī)分組，分為對照組、生理鹽水組、小劑量組、中劑量組和大劑量組，每組6只。

1.4.2CNV造模方法：小鼠常規(guī)腹腔注射麻醉(3 mL/kg、1%戊巴比妥鈉)，復(fù)方托吡卡胺滴眼液散瞳后，在裂隙燈下通過角膜接觸鏡將倍頻577 nm Nd：YAG激光(能量180 mW、光斑100 μm、曝光時(shí)間100 ms)導(dǎo)入眼內(nèi)，在距離視盤1～2 PD處圍繞視盤擊射視網(wǎng)膜，每只小鼠雙眼擊射6個(gè)光凝點(diǎn)。光凝后以有小氣泡產(chǎn)生為準(zhǔn)，可伴輕響或少量出血，表示已經(jīng)擊破Bruch膜。

1.4.3干預(yù)及治療方法：激光造模后第2天開始給藥，對照組與生理鹽水組10 mL/(kg·d)生理鹽水灌胃，小劑量組、中劑量組和大劑量組每日分別給予0.34 g/(kg·d)、0.68 g/(kg·d)、1.36 g/(kg·d)和血明目片灌胃(藥物以生理鹽水溶解)。

1.4.4視網(wǎng)膜電圖(electroretinogram，ERG)記錄方法[8]：參照本實(shí)驗(yàn)室建立的小動物ERG記錄標(biāo)準(zhǔn)化方案對實(shí)驗(yàn)動物右眼進(jìn)行ERG檢測。具體方法如下：檢測前，將實(shí)驗(yàn)動物提前放入小動物暗適應(yīng)箱中進(jìn)行12 h暗適應(yīng)，隨后在微弱的紅光下進(jìn)行實(shí)驗(yàn)動物常規(guī)腹腔注射麻醉(3 mL/kg、1%戊巴比妥鈉+50 μL、10%陸眠寧)，復(fù)方托吡卡胺滴眼液散瞳，鹽酸奧布卡因滴眼液角膜表面麻醉后，安放電極(記錄電極為Ag-AgCl角膜環(huán)狀電極，參考電極為不銹鋼頰部針狀電極，接地電極為不銹鋼尾部針狀電極)，隨后進(jìn)行ERG相應(yīng)指標(biāo)的記錄，記錄結(jié)束后取下電極，并給予加替沙星眼用凝膠涂眼。

1.4.5熒光素眼底血管造影(fluorescein fundus angiography，F(xiàn)FA)：小鼠行ERG檢查后將20%熒光素鈉溶液(0.5 mL/kg)自腹腔注入，于注射后1～2 min期間采集FFA圖像。熒光素滲漏強(qiáng)度根據(jù)Takehana等[12]的實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行分級，分級標(biāo)準(zhǔn)如下：0級為無滲漏、1級為輕度滲漏、2級為中度滲漏、3級為重度滲漏。

1.4.6脈絡(luò)膜鋪片新生血管染色：參照文獻(xiàn)[15]報(bào)道方法進(jìn)行脈絡(luò)膜鋪片新生血管染色，具體方法如下：過量麻醉處死小鼠后取出眼球，置于4%多聚甲醛內(nèi)浸泡1 h，顯微鏡下以赤道部為界去除前節(jié)及神經(jīng)視網(wǎng)膜層，在脈絡(luò)膜復(fù)合體上作4～6條放射性切口，用自制漂洗液(0.2 mL tween 20，0.5 g BSA，溶于100 mL PBS中)漂洗5 min重復(fù)5次后，利用FITC標(biāo)記凝集素B4(10 μg/mL)室溫25 ℃孵育4 h，自制漂洗液漂洗5 min重復(fù)5次后，DAPI染核15 min后洗去DAPI，甘油封片。

1.5 統(tǒng)計(jì)方法

2 結(jié)果

2.1 和血明目片對CNV小鼠視網(wǎng)膜功能的影響

ERG是一項(xiàng)客觀反映視網(wǎng)膜功能的指標(biāo)。如圖1和圖2所示，與對照組相比，各干預(yù)組CNV小鼠視網(wǎng)膜功能均下降，表現(xiàn)為暗視3.0 ERG反應(yīng)b波幅值降低(P<0.05)。此外，和血明目片對CNV小鼠視網(wǎng)膜功能具有保護(hù)作用，表現(xiàn)為和血明目片干預(yù)的實(shí)驗(yàn)組與生理鹽水組相比，暗視3.0 ERG反應(yīng)b波幅值相對較高(P<0.05)。并且和血明目片對CNV小鼠視網(wǎng)膜的保護(hù)作用存在明確的量效關(guān)系(圖2)。

圖1 實(shí)驗(yàn)動物暗視3.0 ERG反應(yīng)典型波形Fig.1 Typical scotopic 3.0 ERG of experimental animals

圖2 各組實(shí)驗(yàn)動物暗視3.0 ERG反應(yīng)b波幅值比較注：*P<0.05,**P<0.01Fig.2 Comparison of the b-wave amplitudes of scotopic 3.0 ERG in each groupNote：*P<0.05,**P<0.01

2.2 和血明目片對CNV小鼠FFA檢查結(jié)果的影響

眼底血管造影是臨床檢查眼底血管異常的金標(biāo)準(zhǔn)。如圖3所示，與對照組小鼠相比，各組CNV小鼠眼底存在不同程度的強(qiáng)熒光滲漏，其中和血明目片干預(yù)組(圖3A、B、C)的滲漏明顯輕于生理鹽水組(圖3D)。根據(jù)Takehana等[14]的實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行分級評估的結(jié)果顯示(表1)，與生理鹽水組相比，和血明目片干預(yù)后CNV眼底滲漏程度(P<0.05)。

圖3 實(shí)驗(yàn)動物眼底FFA造影圖像注：A.小劑量組；B.中劑量組；C.大劑量組；D.生理鹽水組；E.對照組Fig.3 Images of fluorescein fundus angiography (FFA) of experimental animalsNote： A. Low dose group; B. Medium dose group;C. High dose group; D. Saline group;E. Control group

表1 各組實(shí)驗(yàn)動物眼底FFA熒光造影滲漏點(diǎn)分析情況Table 1 Analysis of leakage point of fluorescein fundus angiography (FFA) in each group

2.3 和血明目片對CNV小鼠脈絡(luò)膜新生血管形成的影響

脈絡(luò)膜鋪片新生血管染色是CNV病理診斷的金標(biāo)準(zhǔn)。如圖4所示，與對照組小鼠相比，各組CNV小鼠脈絡(luò)膜鋪片上激光光斑周圍均出現(xiàn)不同程度的新生血管(圖4中FITC標(biāo)記的綠光熒光)，其中和血明目片干預(yù)組(圖4A、B、C)與生理鹽水組(圖4D)相比，新生血管較少，表現(xiàn)為和血明目片干預(yù)組脈絡(luò)膜鋪片新生血管明顯少于生理鹽水組(圖5，P<0.05)。

圖4 實(shí)驗(yàn)動物脈絡(luò)膜鋪片新生血管染色圖像注：A.小劑量組；B.中劑量組；C.大劑量組；D.生理鹽水組；E.對照組Fig.4 Images of flat mounts of choroidal neovascularizationNote：A. Low dose group; B. Medium dose group; C. High dose group; D. Saline group; E. Control group

圖5 各組實(shí)驗(yàn)動物CNV面積比較注：*P<0.05Fig.5 Comparison of CNV area in each groupNote: *P<0.05

3 討論

CNV也稱視網(wǎng)膜下新生血管，是一種起源于脈絡(luò)膜血管的異常血管，其誘因主要與外傷、炎癥、腫瘤等一系列因素相關(guān)。CNV形成后由于血管壁通透性高于正常血管，極易導(dǎo)致出血、滲出以及瘢痕的形成，最終導(dǎo)致視力的受損甚至致盲。本實(shí)驗(yàn)研究證實(shí)了和血明目片可以有效抑制激光誘導(dǎo)CNV小鼠模型脈絡(luò)膜新生血管的形成。由于血管壁通透性高的新生血管形成減少，因此和血明目片干預(yù)組CNV小鼠眼底血管滲漏相對較輕。脈絡(luò)膜是眼內(nèi)血流最豐富的組織，主要負(fù)責(zé)視網(wǎng)膜外五層的營養(yǎng)支持。當(dāng)發(fā)生CNV時(shí)，局部脈絡(luò)膜循環(huán)將發(fā)生障礙，最終影響到脈絡(luò)膜供血的外層視網(wǎng)膜功能，而表現(xiàn)出ERG反應(yīng)幅值的下降。和血明目片因有效的抑制了CNV的產(chǎn)生，改善了脈絡(luò)膜局部循環(huán)狀態(tài)，最終保護(hù)了視網(wǎng)膜的功能。

和血明目片主要成分中的地黃、墨旱蓮、牡丹皮具有涼血止血的功效，丹參、川芎、赤芍、郁金和茺蔚子等具有涼血破瘀的功效，菊花、牡丹皮、女貞子等具有養(yǎng)肝明目的功效，能夠保護(hù)視網(wǎng)膜細(xì)胞功能以及促進(jìn)炎性滲漏吸收[14-15]。這些成分都可能是其抑制CNV形成的物質(zhì)，但是其具體機(jī)制尚不明確。CNV的形成受到多方面因素的影響，與其相關(guān)的信號分子包括VEGF、bFGF、HIF-1等[16-17]。除此之外，與其發(fā)病相關(guān)的因素還包括各種細(xì)胞的參與，以及多種生物因子的作用。和血明目片究竟是通過哪一種(或幾種)機(jī)制發(fā)揮治療作用還需進(jìn)一步研究。

綜上所述，本研究從動物實(shí)驗(yàn)角度出發(fā)證實(shí)了和血明目片對CNV 具有一定的治療效果，為和血明目片在CNV相關(guān)疾病的臨床應(yīng)用提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)，同時(shí)也為下一步研究其具體機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。