賈云曉 趙玉瓊 牛苗苗 袁記方 相 磊 戴 鑫 陳 華

(解放軍總醫(yī)院醫(yī)學創(chuàng)新研究部實驗動物中心，北京 100853)

糖化血紅蛋白最早由Rahbar等[1]所發(fā)現(xiàn)，并稱之為“糖尿病患者中的罕見血紅蛋白”。在上世紀八十年代，HbA1c(糖化血紅蛋白的主要成分)被廣泛引入臨床應(yīng)用。HbA1c能反應(yīng)之前2～3個月內(nèi)的平均血漿葡萄糖水平，并且不受短期血糖波動的影響，成為糖尿病患者血糖控制水平監(jiān)控的重要指標。其重要性得到兩個長期臨床試驗(The Diabetes Control and Complications Trial, DCCT 和 UK Prospective Diabetes Study, UKPDS)的驗證[2-3]，并被美國的糖尿病控制指南所接受[4]。在2011年，WHO推薦HbA1c高于6.5%可作為診斷糖尿病的節(jié)點[5]。因此，HbA1c也是糖尿病動物實驗研究經(jīng)常應(yīng)用的檢測指標。

近年來，小型豬成為熱門的的生物醫(yī)學研究模型，這是由于它們與人類在解剖、代謝、生理和病理生理學方面十分相似，而且繁殖率高、倫理上可接受。小型豬應(yīng)用于代謝性疾病和糖尿病的研究也受到廣泛重視[6-7]。我們在巴馬小型豬糖尿病模型研究中，對小型豬的血液HbA1c指標進行了測定，以期為糖尿病模型研究中對這一指標的應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與處理

5～6月齡雄性巴馬小型豬14頭，體質(zhì)量12.6～15.2 kg。購自北京實創(chuàng)世紀巴馬小型豬養(yǎng)殖基地，實驗動物生產(chǎn)許可證號：SCXK(京)2018-0011。實驗在軍事科學院軍事醫(yī)學研究院動物中心完成，實驗動物許可證號： SYXK(軍)2017-0022。實驗期間，動物飼養(yǎng)環(huán)境溫度：20～26 ℃，相對濕度：40%～70%，明暗交替12 h/12 h，動物單籠飼養(yǎng)，自由飲水。將小型豬隨機分為3組，分別為對照組(Control)、高脂飼喂+鏈脲佐菌素(HFD+STZ)組和高膽固醇高脂飼喂+鏈脲佐菌素(HCFD+STZ)組(表1)。對照組動物常規(guī)飼料飼喂，HFD+STZ組和HCFD+STZ組動物在分別飼喂高脂飼料或高膽固醇高脂飼料(飼料成分見表2)。飼料按照體質(zhì)量的3%投喂，并根據(jù)每月的體質(zhì)量變化進行調(diào)整。

表1 實驗動物分組與處理Table 1 Grouping and treatment of experimental animals

表2 實驗應(yīng)用飼料的主要成分比例Table 2 Proportion of main components of fodder In the experiment %

1.2 檢測指標

1.2.1體質(zhì)量：1次/月(上午8:30～10:30、空腹測體質(zhì)量)。

1.2.2空腹血糖(GLU)、空腹血清胰島素(INS)、肝和腎功能指標(ALT、AST、CRE、BUN)：1次/月。檢測委托北方生物技術(shù)研究所有限公司完成。胰島素檢測采用放射免疫法(西安核儀廠xh6080放免儀)。

1.2.3HbA1c：1次/月。檢測委托北方生物技術(shù)研究所有限公司完成。血液置含有EDTA-K2抗凝劑的采血管中送檢。以BIO-RAD 血紅蛋白檢測系統(tǒng)(D-10 Hemoglobin Testing System)，應(yīng)用離子交換高壓液相法(HPLC)檢測全血中的HbA1c。所用試劑為REF 220-0101，糖化血紅蛋白A1c檢測試劑盒。

2 結(jié)果

2.1 一般臨床觀察

實驗期間對照組動物狀態(tài)良好，飲食正常。實驗組動物在實驗的前3個月被毛比對照組更順滑，并逐漸變得肥胖。在應(yīng)用STZ后狀態(tài)明顯變差，表現(xiàn)為精神萎靡、食欲不振，3 d后動物的狀態(tài)逐漸恢復(fù)正常，但是動物在此后的觀察期內(nèi)開始逐漸消瘦。其中，HCFD+STZ組有1只動物在應(yīng)用STZ后5個月出現(xiàn)酸中毒跡象，給予胰島素治療直至實驗結(jié)束。胰島素應(yīng)用劑量：0.44 U/kg，皮下注射(SC)，1次/d(地特胰島素注射液，丹麥諾和諾德公司，國藥準字J20140107)。

HFD+STZ組和HCFD+STZ組在應(yīng)用STZ后，各有1只動物未出現(xiàn)高血糖。由于此后的觀察我們更關(guān)注高血糖的影響，因此，這2只未出現(xiàn)高血糖癥狀的動物在應(yīng)用STZ后的數(shù)據(jù)不納入統(tǒng)計分析。

2.2 體質(zhì)量

對照組動物飼喂常規(guī)飼料，實驗期間體質(zhì)量逐漸增長。飼喂高脂/高膽固醇高脂飼料的動物，在實驗的前3個月體質(zhì)量增長快于對照組(P<0.01)，注射STZ后體質(zhì)量開始下降，在實驗第4個月開始與對照組無明顯差異，并持續(xù)至實驗結(jié)束(圖1)。

圖1 實驗期間動物體質(zhì)量變化Fig.1 Changes of animal weight during the experiment

2.3 空腹血糖、空腹血清胰島素和HOMA-IR指數(shù)

2.3.1空腹血糖(圖2A)：實驗期間對照組動物空腹血糖值為3.2～4.2 mmol/L。實驗組(HFD+STZ 組和HCFD+STZ組)動物中，每組各有1只動物的空腹血糖值在實驗期間變化不大，分別為2.9～4.9 mmol/L 和3.4～7.8 mmol/L，其余動物在注射STZ后空腹血糖值較注射STZ前顯著升高，與對照組相比差異極顯著(P<0.01)，并持續(xù)至實驗結(jié)束，空腹血糖測定值分別在15.4～31.1 mmol/L 和10.3～29.4 mmol/L之間波動。

2.3.2空腹血清胰島素(圖2B)：實驗期間對照組動物空腹血清胰島素值在8.36～17.64 μIU/mL范圍內(nèi)波動，檢測值變異幅度較大。實驗組(HFD+STZ 組和HCFD+STZ組)動物的空腹胰島素值在前3個月與對照組差異不明顯，在應(yīng)用STZ后開始減低，并持續(xù)至實驗結(jié)束(4個月，HCFD+STZ組較對照組差異顯著，P<0.05；8個月、9個月，HFD+STZ 組和HCFD+STZ組較對照組均差異顯著，P<0.05)。

2.3.3HOMA-IR(圖2C)：實驗期間對照組動物的HOMA-IR值為1.56～2.67，變異幅度較大。實驗組(HFD+STZ組和HCFD+STZ組)動物的HOMA-IR值在前3個月與對照組差異不明顯，在注射STZ后明顯升高，較對照組有顯著差異(P<0.05 或P<0.01)，并持續(xù)至實驗結(jié)束。

圖2 實驗期間動物空腹血糖、空腹胰島素和HOMA-IR指數(shù)變化情況注：與對照組相比，▲P<0.01，*P<0.05；與對照組相比，★P<0.01, #P<0.05Fig.2 Changes of GLU,INS and HOMA-IR during the experimentNote： Compared with control group，▲P<0.01, *P<0.05；Compared with control group，★P<0.01, #P<0.05

2.4 HbA1c

對照組動物在實驗期間HbA1c的測定值在2.9%～5.5%之間，各檢測時間點平均值無明顯差異。HFD+STZ組和HCFD+STZ組動物的測定值分別在1.7%～4.4%和2.5%～5.8%之間波動，各檢測時間點平均值3組之間無明顯差異(圖3)。

圖3 實驗期間動物HbA1c測定值Fig.3 Values of HbA1c during the experiment

2.5 肝功能和腎功能指標

對照組ALT的所有測定值在25.0～73.0 mmol/L之間波動，AST的所有測定值在14.0～67.0 mmol/L之間波動，CRE的所有測定值在46.0～164.0 mmol/L之間波動，BUN的所有測定值在1.3～5.8 mmol/L之間波動。兩個實驗組各時間點ALT、AST、CRE和BUN的測定值均與對照組差異不顯著。

3 討論

本實驗應(yīng)用高脂/高膽固醇高脂飼料飼喂誘導巴馬小型豬3個月后，再注射90 mg/kg的STZ，繼續(xù)誘導6個月，通過空腹血糖、空腹血清胰島素、HOMA-IR等各項指標判定，我們成功地建立了小型豬糖尿病模型。HFD+STZ 組和HCFD+STZ組的8頭小型豬在注射STZ后血糖濃度顯著升高，空腹血糖測定值分別達到了15.4～31.1 mmol/L 和10.3～29.4 mmol/L，并持續(xù)至實驗結(jié)束。然而，實驗組動物的HbA1c測定值卻沒有發(fā)生明顯變化，即使動物的高血糖持續(xù)了6個月，實驗組動物的HbA1c測定值也沒有明顯升高，各檢測時間點均表現(xiàn)與對照組差異不顯著，說明HbA1c值并未準確反映出實驗期間實驗動物體內(nèi)的血糖變化情況。

糖化血紅蛋白是血紅蛋白和糖類之間簡單的化學反應(yīng)的結(jié)果，是在血紅蛋白合成完成后的翻譯后修飾。糖化血紅蛋白的形成包括兩步非酶促的化學反應(yīng)。第一步，葡萄糖與β球蛋白鏈N末端的纈氨酸殘基結(jié)合形成一個醛亞胺化合物，這是一步可逆的反應(yīng)。第二步，由Amadori反應(yīng)介導的醛亞胺化合物的內(nèi)部重排，產(chǎn)生一個穩(wěn)定的氨基酮衍化物。糖化血紅蛋白依據(jù)攜帶電荷的不同，可以應(yīng)用離子交換樹脂進行分離，按照洗脫順序命名，分別為A0、A1a、A1b和A1c，A1c是糖化血紅蛋白的主要組分[8]。

穩(wěn)定的HbA1c一旦形成就一直存在于紅細胞中，直到它們從循環(huán)中移出。新生紅細胞增加(血紅蛋白尚未修飾)，會導致總的HbA1c濃度的明顯減少。相反，一個相對短期的血糖升高，可迅速和不可逆地增加所有循環(huán)中紅細胞的HbA1c濃度。亦即，HbA1c的濃度對新發(fā)高血糖敏感，而對以前的高血糖結(jié)果的修復(fù)不敏感。Graf等[9]最先指出，環(huán)境(血液)的葡萄糖濃度與HbA1c相關(guān)，通過紅細胞的壽命和血紅蛋白的糖化反應(yīng)速度可預(yù)測HbA1c濃度。Beach[10]的研究表明，在實驗條件下，能夠?qū)崿F(xiàn)這種預(yù)測。此后，HbA1c的檢測逐步引入臨床應(yīng)用，成為一段時間內(nèi)血糖控制程度的監(jiān)測指標。

在動物實驗研究中，已經(jīng)有小鼠、大鼠、家兔、犬、猴和狒狒糖化血紅蛋白的檢測報道[11-16]，盡管結(jié)果變異很大，但是和人類一樣，也表現(xiàn)出在糖尿病動物體內(nèi)出現(xiàn)升高。糖化血紅蛋白水平在不同動物種類之間變異很大，因為其差別不僅與紅細胞壽命有關(guān)，而且與紅細胞對葡萄糖的通透性相關(guān)。Higgins等[17]利用血液樣本，比較了人類、狒狒、恒河猴、犬、兔和豬的體內(nèi)糖化血紅蛋白情況。結(jié)果測得血漿血糖與紅細胞內(nèi)血糖的比例平均值分別為：67.1%、77%、70.8%、34.2%、19.2%和3.8%。這表明狒狒和恒河猴的紅細胞的葡萄糖通過性與人類差異不顯著，犬、兔和豬的紅細胞的葡萄糖通過性明顯低于人類。他們利用Bia-Rex 70色譜，以瓊脂糖凝膠電泳分離HbA1c，結(jié)果測得6種動物血液的HbA1c平均值分別為4.9%、3.5%、3.3%、3.3%、1.4%和0。這也是我們檢索到的唯一有關(guān)豬糖化血紅蛋白檢測的文獻。我們的實驗結(jié)果與之不同，即在巴馬小型豬血液中檢出HbA1c，所有動物的檢測值在1.7%～5.8%范圍內(nèi)波動，但平均值明顯低于人類的正常值，隨著血糖的升高，變化不明顯。

在糖化血紅蛋白發(fā)現(xiàn)后的大約20年，色譜分析是糖化血紅蛋白的唯一可用的檢測方法。現(xiàn)在，檢測方法已經(jīng)發(fā)展了近40種，按照理化性質(zhì)原理可以分為兩大類，一類是依據(jù)電荷差異，即血紅蛋白的糖化與非糖化2種形式所攜帶的電荷不同，如離子交換層析法、電泳法等；另一類是依據(jù)結(jié)構(gòu)差異，即血紅蛋白糖化與非糖化2種形式結(jié)構(gòu)不同，如免疫法、親和層析法等。Higgins等的研究發(fā)表于1982年[17]，他們采用了離子交換層析法，利用的Bio-Rex 70離子交換樹脂(Bio-Rad, Inc)。此方法檢測結(jié)果易受HbA1c前體(Schiff堿)、胎兒血紅蛋白(HbF)、衍生血紅蛋白(甲?；蛞阴；t蛋白)及變異血紅蛋白(HbS、HbS、HbS和HbS)等因素的干擾，對pH和溫度敏感。1992年，美國病理學家學會發(fā)布了1份調(diào)查報告，指出HbA1c檢測結(jié)果存在較大偏差，對于一些血液樣本，HbA1c檢測結(jié)果的報告變異范圍達到4%～8.1%[18]。這一報告表明，為了改善糖尿病人的管理，需要引入標準化的HbA1c檢測。我們的研究選用了高效液相色譜法(HPLC)，克服了pH值、溫度及其他一些影響因素，減少了對HbA1c峰的干擾，對HbA1c的分離可以達到臨床需求的精密度和穩(wěn)定性。因此，HPLC已經(jīng)作為HbA1c標準化參考系統(tǒng)的參考方法[19]。綜上所述，我們推測小型豬的紅細胞對葡萄糖的通透性較低，其血液HbA1c檢測無法準確反映血糖的變化情況，不適于小型豬糖尿病研究中對血糖控制水平的監(jiān)測。