陸軼杰，蔣新衛(wèi)，吳建武

（南京醫(yī)科大學(xué)附屬蘇州醫(yī)院 肝膽外科，江蘇 蘇州 215000）

肝癌是臨床最常見的惡性腫瘤之一，發(fā)病率和病死率在惡性腫瘤中居于前列[1-2]。近年來，肝癌的早期診斷以及全面規(guī)范治療方面取得了較大進(jìn)展，但肝癌的整體生存率并沒有得到顯著的改善[3-4]。肝癌病死率高的主要原因是患者的早期癥狀不明顯，很多患者發(fā)現(xiàn)時(shí)多為中晚期[5]。此外，由于肝癌惡性度高，易復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移，許多患者沒有手術(shù)機(jī)會(huì)[6]。因此，尋找肝癌早期診斷和治療的標(biāo)志物具有重要意義。

微小RNA（miRNAs）是一類具有調(diào)控功能的非編碼RNA，長(zhǎng)度在20～25個(gè)核苷酸。研究發(fā)現(xiàn)miRNA的表達(dá)與多種惡性腫瘤相關(guān)[7-8]。其可直接或間接激活以及抑制原癌基因/抑癌基因的表達(dá)，進(jìn)而影響腫瘤細(xì)胞的增殖、凋亡、分化、侵襲和轉(zhuǎn)移[9-10]。因此，對(duì)肝癌細(xì)胞增殖的分子標(biāo)志物探索，尋找新的治療靶點(diǎn)，探究肝癌細(xì)胞增殖機(jī)制是當(dāng)前肝癌研究的熱點(diǎn)[11]。有文獻(xiàn)報(bào)道，miR-1470在食管癌的發(fā)生發(fā)展中具有重要作用[12]，但其在肝癌中的功能作用尚未被研究。因此，本研究利用體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)觀察miR-1470對(duì)人肝癌細(xì)胞增殖和凋亡中的影響，為探討其在肝癌發(fā)生發(fā)展中的作用機(jī)制提供新的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

人肝癌細(xì)胞株（HepG2、Hep3B、Huh7）和人正常肝細(xì)胞株（LO2）購(gòu)自ATCC公司；胎牛血清（FBS）購(gòu)自Gibco公司，RPMI-1640培養(yǎng)基購(gòu)自Hycolone公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)：將人肝癌細(xì)胞株（HepG2、Hep3B、Huh7）和人正常肝細(xì)胞株（LO2）用含10% FBS和雙抗（100 U/mL青霉素和100 mg/L鏈霉素）的RPMI-1640培養(yǎng)基，在37 ℃含5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 細(xì)胞的轉(zhuǎn)染：以每孔2×105細(xì)胞將細(xì)胞接種與6孔板中。將轉(zhuǎn)染細(xì)胞分為三組，貼壁后更換為不含抗生素的培養(yǎng)液。轉(zhuǎn)染細(xì)胞24 h后，吸棄含病毒的培養(yǎng)液，換完全培養(yǎng)基。待轉(zhuǎn)染后細(xì)胞長(zhǎng)滿6孔板，將細(xì)胞轉(zhuǎn)入10 cm培養(yǎng)皿，加入1 mg/L的嘌呤霉素篩選，待細(xì)胞耐受該濃度后逐漸升高嘌呤霉素濃度至3 mg/L至細(xì)胞耐受則篩選基本完成，病毒達(dá)到穩(wěn)定轉(zhuǎn)染。篩選完成后采用實(shí)時(shí)定量PCR（RT-qPCR）法檢測(cè)miR-1470表達(dá)量，評(píng)價(jià)干擾效率。本研究分別設(shè)對(duì)照組（NC）、miR-1470過表達(dá)組或miR-1470抑制組。過表達(dá)組通過已構(gòu)建好的過表達(dá)miR-1470慢病毒載體，從而上調(diào)miR-1470的表達(dá)；抑制組則通過脂質(zhì)體（lipofectamine 2000）將shRNA質(zhì)粒轉(zhuǎn)染入肝癌細(xì)胞，從而下調(diào)miR-1470的表達(dá)。

1.2.3 RT-qPCR法：收集待測(cè)細(xì)胞，加入Trizol 1 mL，提取總RNA。以2 μg RNA為模板，在Takara反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書的指導(dǎo)下，合成cDNA。以cDNA為模板，用SYBR Premix Ex Taq試劑盒進(jìn)行RT-qPCR反應(yīng)，其反應(yīng)條件為：95 ℃ 10 min；95 ℃ 15 s；60 ℃60 s，40個(gè)循環(huán)。

1.2.4 CCK8檢測(cè)細(xì)胞增殖情況：在96孔板中以1 000～2 000個(gè)細(xì)胞/孔的密度接種細(xì)胞，每個(gè)處理組細(xì)胞接種4個(gè)副孔，并設(shè)置單培養(yǎng)液的空白對(duì)照孔。完全培養(yǎng)基連續(xù)培養(yǎng)6 d，每天在同一時(shí)間進(jìn)行CCK-8孵育及檢測(cè)。培養(yǎng)過程中每孔加入培液200 μL。檢測(cè)前，吸棄培養(yǎng)孔中的培養(yǎng)液，加入以1:10配制的CCK-8溶液，繼續(xù)孵育2 h。隨后利用酶標(biāo)儀，在450 nm的波長(zhǎng)下測(cè)量吸光度。細(xì)胞吸光值=樣品孔吸光值-空白對(duì)照孔吸光值。

1.2.5 流式細(xì)胞法檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況：用不含EDTA的胰酶消化待測(cè)細(xì)胞，終止后1 000 r/min離心5 min，PBS洗滌兩次，最后用500 μL binding buffer重懸后，每管先后加入FITC-Annexin V和PI各5 μL，室溫避光孵育15 min，流式細(xì)胞儀分析凋亡率。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 miR-1470在肝細(xì)胞中的表達(dá)

采用qRT-PCR方法檢測(cè)人肝癌細(xì)胞（HepG2、Hep3B、Huh7）和人正常肝細(xì)胞（LO2）miR-1470的表達(dá)水平。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，miR-1470在肝癌細(xì)胞中的表達(dá)水平明顯高于人正常肝細(xì)胞，相對(duì)正常細(xì)胞表達(dá)量分別為：2.304±0.366、2.851±0.508、5.768±0.445，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，見圖1）。

2.2 miR-1470在各組細(xì)胞轉(zhuǎn)染后的表達(dá)水平

為了檢測(cè)miR-1470在肝癌細(xì)胞中的生理功能，本研究選擇HepG2和Huh7細(xì)胞株轉(zhuǎn)染。隨后進(jìn)行RT-qPCR檢測(cè)轉(zhuǎn)染效率。與對(duì)照（NC）組相比，過表達(dá)組miR-1470相對(duì)表達(dá)量為：4.592±0.582，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，見圖2A）；相對(duì)對(duì)照組，抑制組miR-1470相對(duì)表達(dá)量為：1.176±0.226，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，見圖2B）。這提示過表達(dá)miR-1470的HepG2細(xì)胞株和抑制miR-1470的Huh7細(xì)胞株構(gòu)建成功。

圖1 miR-1470在LO2、HepG2、Hep3B、Huh7細(xì)胞中的表達(dá)水平

2.3 miR-1470對(duì)肝癌細(xì)胞增殖能力的影響

通過CCK8實(shí)驗(yàn)，過表達(dá)組OD值在72 h顯著高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，見圖3A），而抑制組顯著低于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，見圖3B）。這提示過表達(dá)miR-1470能夠促進(jìn)肝癌細(xì)胞的增殖。

2.4 miR-1470對(duì)肝癌細(xì)胞凋亡的影響

流式細(xì)胞儀分析結(jié)果顯示，過表達(dá)miR-1470抑制了肝癌細(xì)胞的凋亡（P＜0.05，見圖4A）；而抑制組采用shRNA干擾miR-1470的表達(dá)后，凋亡細(xì)胞顯著增多（P＜0.05，見圖4B）。這提示miR-1470在參與調(diào)控肝癌細(xì)胞凋亡中發(fā)揮重要作用。

3 討論

目前，肝癌仍是世界范圍內(nèi)生存期較短、病死率高的惡性腫瘤[13]。肝癌臨床癥狀隱匿，亟待人們探索新的肝癌生物標(biāo)志物和探索新的治療策略。miRNAs已被證實(shí)在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中具有重要作用[14]。miRNA功能失調(diào)可能導(dǎo)致腫瘤發(fā)生、進(jìn)展或腫瘤抑制等多種結(jié)果[15]。因此，研究miRNA的生理功能及其潛在的分子機(jī)制將為肝癌的診斷、治療和預(yù)后提供新的方向。

圖2 miR-1470在過表達(dá)組（A圖：HepG2細(xì)胞株）及抑制組（B圖：Huh7細(xì)胞株）中的表達(dá)水平

圖3 CCK8實(shí)驗(yàn)檢測(cè)過表達(dá)組（A圖：HepG2細(xì)胞株）及抑制組（B圖：Huh7細(xì)胞株）在不同時(shí)間點(diǎn)吸光度值的變化

圖4 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)過表達(dá)組（A圖：HepG2細(xì)胞株）及抑制組（B圖：Huh7細(xì)胞株）細(xì)胞凋亡率的變化

miRNA的研究已有多年，其生物學(xué)功能也廣為人知，大量研究已證實(shí)miRNA在肝癌中具有重要作用。其中，miR-122、miR-21被認(rèn)為是肝臟中高度特異性表達(dá)的miRNA[16-17]。過表達(dá)miRNA-200a能夠明顯抑制肝細(xì)胞癌的代謝能力[18]。miRNA-612抑制肝細(xì)胞癌的多能性，對(duì)腫瘤大小和數(shù)目有負(fù)調(diào)控作用[19]。miRNA-30c則通過結(jié)合IER2參與調(diào)節(jié)肝細(xì)胞癌的遷徙和侵襲[20]。miR-1470位于19p13.12染色體上，已被證實(shí)在食管鱗癌細(xì)胞中具有致癌作用[12]。然而，miR-1470在肝癌細(xì)胞中的功能尚未見報(bào)道。

通過本次研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)miR-1470在肝癌細(xì)胞系中過表達(dá)。CCK8實(shí)驗(yàn)證明miR-1470可以促進(jìn)肝癌細(xì)胞增殖。細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)顯示miR-1470過表達(dá)可以抑制肝癌細(xì)胞的凋亡。綜上所述，我們認(rèn)為miR-1470上調(diào)在肝癌發(fā)生中起致癌作用。

然而，本次研究?jī)H是初步證實(shí)miR-1470參與調(diào)控肝癌細(xì)胞增殖和凋亡，但具體調(diào)控機(jī)制尚不明確。miRNA可能通過調(diào)節(jié)下游靶基因發(fā)揮生理功能[21]。有關(guān)miR-1470的潛在靶點(diǎn)，目前尚無相關(guān)報(bào)道，需要進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)證明。