石銀濤，王繪軍，王俊偉，鄭經(jīng)，吳玉紅

（1.重慶市公安局物證鑒定中心，重慶 400021；2.重慶警察學(xué)院，重慶 401331；3.重慶市毒物毒品分析重點實驗室，重慶 401331）

安眠鎮(zhèn)靜類藥物具有鎮(zhèn)靜、催眠、抗驚厥以及中樞性肌肉松弛等作用，并且該類藥物具有價格便宜、易得、催眠鎮(zhèn)靜作用起效快、安全范圍大等特點，在臨床上廣泛使用。而安眠鎮(zhèn)靜類藥物的臨床不合理用藥、誤服誤用、自殺他殺、麻醉搶劫和麻醉強奸等導(dǎo)致每年都發(fā)生大量的安眠鎮(zhèn)靜類藥物攝毒案（事）件，引發(fā)公共安全事件和刑事案件[1-3]。安眠鎮(zhèn)靜類藥物具有用量小、代謝快、半衰期短等特點[4-5]，在體內(nèi)組織和體液中濃度很低。因此，開展安眠鎮(zhèn)靜類藥物及其代謝產(chǎn)物的高靈敏度檢測方法的研究對法庭刑事案件偵破和臨床診斷治療具有十分重要的意義。

目前，安眠鎮(zhèn)靜類藥物及其代謝產(chǎn)物的檢測方法主要有氣相色譜法（gas chromatography，GC）[6]、高效液相色譜法（high performance liquid chromatography，HPLC）[7-8]、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）[9-11]、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法（liquid chromatography-mass spectrometry，LC-MS）[12-19]。GC和LC樣品中的基質(zhì)干擾使檢測容易出現(xiàn)假陽性，GC-MS方法檢出限高，容易出現(xiàn)漏檢。液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（liquid chromatography-tandem mass spectrometry，LC-MS/MS）因具有特異性強、靈敏度高、重現(xiàn)性好、線性動態(tài)范圍寬等特點[20]，在安眠鎮(zhèn)靜類藥物檢驗中應(yīng)用廣泛。然而，現(xiàn)有LC-MS/MS檢驗方法絕大多數(shù)針對安眠鎮(zhèn)靜類藥物中的一種或幾種藥物進行研究[13，16-17]，而且對其代謝產(chǎn)物的研究相對較少。面對多種安眠鎮(zhèn)靜類藥物及其代謝產(chǎn)物的同時檢測要求，建立一種靈敏度高、專屬性強，快速、準(zhǔn)確、能同時檢測多種安眠鎮(zhèn)靜類藥物及其代謝產(chǎn)物分析方法顯得尤為迫切。本研究旨在建立液液萃取-液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜檢測血液中多塞平、米氮平、阿米替林、氯氮平、卡馬西平、地西泮、艾司唑侖、阿普唑侖、三唑侖、氯氮藍卓、氟硝西泮、氯硝西泮和代謝產(chǎn)物7-氨基氯硝西泮共13種安眠鎮(zhèn)靜類藥物及其代謝物的方法。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

Triple Quad 5500 LC-MS/MS系統(tǒng)（美國SCIEX公司），ACQUITY Ultra Performance LCTM系統(tǒng)（美國Waters公司），Allegra X-22R Centrifuge型冷凍離心機（美國Beckman公司），Direct-Q3型純水機（美國Millipore公司），ML104電子天平（萬分之一，瑞士Mettler-Toledo公司）。

乙腈、甲醇、甲酸銨、甲酸（色譜純，美國TEDIA公司），其他試劑均為分析純。

多塞平、米氮平、阿米替林、氯氮平、卡馬西平、地西泮、艾司唑侖、阿普唑侖、三唑侖、氯氮藍卓、氯硝西泮、氟硝西泮、7-氨基氯硝西泮和地西泮-d5，純度≥98.0%，均購自美國Sigma公司。13種安眠鎮(zhèn)靜類藥物及其代謝物標(biāo)準(zhǔn)品和地西泮-d5分別用甲醇配制成10μg/mL的儲備液，于-20℃冷凍保存?zhèn)溆?。上述儲備液根?jù)需要用甲醇稀釋成不同質(zhì)量濃度的13種安眠鎮(zhèn)靜類藥物及其代謝物混合標(biāo)準(zhǔn)品工作液。地西泮-d5用甲醇稀釋成1μg/mL的內(nèi)標(biāo)工作液。

1.2 樣品前處理

取血液1mL置于15mL具塞離心管中，加入50μL地西泮-d5內(nèi)標(biāo)工作液（1 μg/mL），加入7 mL乙酸乙酯，渦旋振蕩10 min，以離心半徑10 cm，9 500 r/min，離心5min，取上清液，于40℃用氮氣吹干，用甲醇定容至200 μL，渦旋，離心，過0.22 μm有機濾膜后，供LC-MS/MS分析。

1.3 色譜及質(zhì)譜條件

色譜條件：ACQUITY Ultra Performance LC?BEH C18（100mm×2.1mm，1.7μm）；流動相為甲醇（A）和含20mmol/L甲酸銨的0.1%甲酸水溶液（B）。梯度洗脫程序：0～1.0 min，90%B；1.0～2.0 min，90%～10%B；2.0～4.0 min，10%B；4.0～4.1 min，10%～90%B；4.1～7.0min，90%B；總采樣時間為7min；流速0.3mL/min；柱溫35℃；進樣量2μL。

質(zhì)譜條件：電噴霧正離子-多反應(yīng)監(jiān)測檢測；氣簾氣為20 psi，離子源霧化氣為60 psi，離子源加熱輔助氣為55 psi，碰撞氣為8，噴霧電壓為5 500 V，加熱器溫度為550℃。

1.4 方法學(xué)驗證

1.4.1 選擇性

6個不同來源的空白血液樣品按“1.2節(jié)”方法處理后進行LC-MS/MS分析，觀察血液中內(nèi)源性物質(zhì)對13種安眠鎮(zhèn)靜類藥物及其代謝物的檢測是否有干擾。

1.4.2 提取樣品pH值的選擇

取空白血液1mL于15mL具塞離心管中，添加的13種安眠鎮(zhèn)靜類藥物及其代謝物混合標(biāo)準(zhǔn)溶液制成50μg/L的樣品，用稀鹽酸調(diào)節(jié)樣品pH值為3和5，用飽和Na2CO3溶液調(diào)節(jié)pH值為9和11，空白血液的pH值為7，按“1.2節(jié)”方法處理、分析，比較樣品pH值分別為3、5、7、9和11時的提取回收率。

1.4.3 線性關(guān)系與檢出限

取空白血液1 mL于15 mL具塞離心管中，加入13種安眠鎮(zhèn)靜類藥物及其代謝物的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，配制成質(zhì)量濃度為0.1～200 μg/L系列血樣樣品，按“1.2節(jié)”方法處理、分析。以血液中目標(biāo)物的質(zhì)量濃度（x）為橫坐標(biāo)，以血液中目標(biāo)物與內(nèi)標(biāo)的峰面積之比（y）為縱坐標(biāo)，進行線性回歸。

1.4.4 準(zhǔn)確度和精密度

取空白血液1mL于15mL具塞離心管中，添加不同量的13種安眠鎮(zhèn)靜類藥物及其代謝物混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別配制成低、中、高3個質(zhì)量濃度（10、50、200 μg/L）的血液樣品，每個質(zhì)量濃度點6份樣品，按“1.2節(jié)”方法處理、分析，連續(xù)測定3 d。準(zhǔn)確度用偏倚（%）表示，日內(nèi)精密度（relative standard deviations，RSD）和日間精密度（RSD）計算公式如下：

式中，X為平均濃度，μ為標(biāo)準(zhǔn)添加濃度，Sw和Sb分別為日內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)偏差和日間標(biāo)準(zhǔn)偏差。

1.4.5 回收率

取空白血液1mL于15mL具塞離心管中，將13種安眠鎮(zhèn)靜類藥物及其代謝物混合標(biāo)準(zhǔn)溶液分別配制成低、中、高3個質(zhì)量濃度的血液樣品，每個質(zhì)量濃度點6份樣品，按“1.2節(jié)”方法處理，按1.3節(jié)分析后的色譜峰面積（S3）與空白樣品基質(zhì)提取液添加相應(yīng)的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液后的色譜峰面積（S2）的比值計算回收率（RE）。

1.4.6 基質(zhì)效應(yīng)

基質(zhì)效應(yīng)是指基質(zhì)中的共提取干擾物影響目標(biāo)物的離子化，從而使目標(biāo)物在儀器上的響應(yīng)發(fā)生增強或抑制。因此，需要對目標(biāo)物在不同基質(zhì)中的基質(zhì)效應(yīng)進行評價，并根據(jù)評價結(jié)果選擇適合的方法對基質(zhì)效應(yīng)進行抵消[21]。分別測定混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的色譜峰面積（S1）和空白樣品基質(zhì)提取液添加標(biāo)準(zhǔn)溶液后的色譜峰面積（S2），以比值S2/S1（%）評價基質(zhì)效應(yīng)。

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜及質(zhì)譜條件的選擇

2.1.1 色譜條件的選擇

本實驗選取C18色譜柱作為分析用色譜柱。實驗比較了甲醇和乙腈、0.1%甲酸水溶液和含20 mmol/L甲酸銨的0.1%甲酸水溶液、等度洗脫和梯度洗脫對分析結(jié)果的影響。實驗結(jié)果表明：梯度洗脫優(yōu)于等度洗脫，選擇甲醇梯度洗脫分析時，各化合物的分離效果好，響應(yīng)值高，基質(zhì)干擾弱。含20mmol/L甲酸銨的0.1%甲酸水溶液優(yōu)于0.1%甲酸水溶液，加少量的鹽后，各化合物的保留時間穩(wěn)定。因此，選用20mmol/L甲酸銨（含0.1%甲酸）水溶液-甲醇為流動相。

2.1.2 質(zhì)譜條件的選擇

本研究中13種安眠鎮(zhèn)靜類藥物及其代謝物結(jié)構(gòu)中有易于和H+結(jié)合的帶有孤對電子的N原子，因此選擇電噴霧正離子（ESI+）作為電離模式。采用針泵直接進樣，確定目標(biāo)物的母離子，采用子離子掃描方式進行二級質(zhì)譜掃描，按照響應(yīng)強度從高到低的原則選取兩個以上的碎片作為子離子，并優(yōu)化各子離子的電壓參數(shù)。13種安眠鎮(zhèn)靜類藥物及其代謝物、內(nèi)標(biāo)的具體質(zhì)譜參數(shù)見表1。

表1 13種安眠鎮(zhèn)靜類藥物及其代謝物、內(nèi)標(biāo)的質(zhì)譜參數(shù)Tab.1 Mass spectrum parameters of 13 hypnotic and sedative drugs，their metabolites and internal standards

2.2 方法學(xué)驗證

2.2.1 選擇性

實驗結(jié)果表明，6個不同來源的空白血液樣品的內(nèi)源性物質(zhì)不干擾13種安眠鎮(zhèn)靜類藥物及其代謝物的測定，該方法的專屬性良好。圖1為添加標(biāo)準(zhǔn)品（100μg/L）和添加內(nèi)標(biāo)的血液樣品的總離子圖。

2.2.2 提取樣品pH值選擇

隨著pH值的增加，目標(biāo)物的提取回收率也逐漸提高，但當(dāng)pH=9、pH=11時，目標(biāo)物的回收率依次降低，在pH=7時回收率最高。故樣品pH值最終選擇為7。

圖1 血液樣品的總離子流圖Fig.1 Total ion flow diagram of blood sample

2.2.3 線性關(guān)系及檢出限

血液中13種安眠鎮(zhèn)靜類藥物及其代謝物的線性方程、相關(guān)系數(shù)及檢出限見表2。在5～200μg/L質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，血液中13種安眠鎮(zhèn)靜類藥物及其代謝物均呈良好的線性關(guān)系。

表2 目標(biāo)物的線性方程、相關(guān)系數(shù)及檢出限Tab.2 Linear equation，correlation coefficient and detection limit of targets

2.2.4 準(zhǔn)確度和精密度

配制含13種目標(biāo)物10、50、200μg/L 3種質(zhì)量濃度的血液樣品各6份，按“1.2節(jié)”方法處理、按“1.3節(jié)”分析，連續(xù)測定3 d。計算各濃度血樣測定結(jié)果的準(zhǔn)確度。用上述3種質(zhì)量濃度的標(biāo)準(zhǔn)血液樣品，1d內(nèi)分析6次，得日內(nèi)RSD；連續(xù)測定3 d，每天1次，得日間RSD。日內(nèi)和日間RSD不大于8.6%，準(zhǔn)確度（偏倚）在±9.8%范圍內(nèi)（表3）。

2.2.5 回收率

血液中13種安眠鎮(zhèn)靜類藥物及其代謝物在3個添加質(zhì)量濃度（10、50、200 μg/L）的回收率見表 3。13種安眠鎮(zhèn)靜類藥物及其代謝物的平均回收率在71.2%～93.4%，滿足日常檢案的要求。

表3 目標(biāo)物的準(zhǔn)確度、回收率、基質(zhì)效應(yīng)和精密度Tab.3 Accuracy，recovery，matrix effect and precision of targets （%）

續(xù)表3Continued Tab.3

2.2.6 基質(zhì)效應(yīng)

目標(biāo)物在10、50和200 μg/L質(zhì)量濃度時的基質(zhì)效應(yīng)值說明血液中基質(zhì)對目標(biāo)物的測定具有較強的抑制作用（表3）。由于基質(zhì)效應(yīng)明顯，本研究最終采用內(nèi)標(biāo)法以降低基質(zhì)效應(yīng)的影響。

2.3 實際案例分析

重慶居民譚某于某年12月4日18：00左右在江北區(qū)一家火鍋店和朋友一起吃飯，吃完飯后和幾個朋友打牌，在打牌過程中譚某感覺意識不清、昏昏欲睡，并被詐騙21萬元。次日10：00左右提取譚某血液。使用本研究建立的方法對受害人譚某的血液進行13種安眠鎮(zhèn)靜類藥物及其代謝物的定性定量檢測，從血液中檢出氯硝西泮和7-氨基氯硝西泮，質(zhì)量濃度分別為 22.3 μg/L 和 196.9 μg/L（圖 2）。據(jù)犯罪嫌疑人交代，在譚某喝的啤酒中投入了安眠鎮(zhèn)靜類藥物。

CHèZE等[22]報道的麻醉搶劫案，受害人飲用1瓶含有2.1mg氯硝西泮的啤酒很快入睡，尿液中檢出氯硝西泮和7-氨基氯硝西泮的質(zhì)量濃度分別為17.8μg/L和561.7μg/L，尿液中7-氨基氯硝西泮的質(zhì)量濃度遠大于氯硝西泮的質(zhì)量濃度。本研究中血液中7-氨基氯硝西泮的質(zhì)量濃度遠大于氯硝西泮的質(zhì)量濃度，可能與采樣時間距離案發(fā)時間較長有關(guān)。

圖2 實際樣品的多反應(yīng)監(jiān)測色譜圖Fig.2 Multi reaction monitoring chromatogram of actual sample

3 結(jié) 論

本研究結(jié)合液液提取與LC-MS/MS技術(shù)，建立了同時測定血液中13種安眠鎮(zhèn)靜類藥物及其代謝產(chǎn)物的分析方法。該方法簡便快速、專屬性強、靈敏度高、重現(xiàn)性好，最低檢出限為0.1～1.0 μg/L。實際案例分析結(jié)果表明，該法適于分析血液中13種安眠鎮(zhèn)靜類藥物及其代謝產(chǎn)物，在法庭與臨床毒物分析中具有重要的應(yīng)用價值。