（中國(guó)醫(yī)科大學(xué)法醫(yī)學(xué)院，遼寧 沈陽(yáng) 110122）

以血氨為代表的生物樣品中的氨是非蛋白氮重要的化學(xué)表現(xiàn)形式，蛋白質(zhì)代謝過(guò)程中產(chǎn)生含氮廢料在肝中通過(guò)鳥(niǎo)氨酸循環(huán)（尿素循環(huán)）合成尿素后由腎排出，在這一過(guò)程中會(huì)有少量的氨生成，構(gòu)成了體內(nèi)氨的正常值本底[1]。在意外攝入大量氨時(shí)也通過(guò)形成尿素的形式進(jìn)行解毒。因此，在臨床檢驗(yàn)中血氨和尿素氮一直作為評(píng)價(jià)肝腎功能的重要指標(biāo)。在法醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，血氨同樣可以用來(lái)評(píng)價(jià)生前的肝功能狀況輔助確定死亡原因，嚴(yán)重肝壞死的個(gè)體血氨值明顯超過(guò)正常值。

此外，如果口服大量尿素可以在胃腸道細(xì)菌作用下產(chǎn)生氨，吸收入血后引起中毒。一些反芻類(lèi)動(dòng)物常常因此中毒死亡[2]。尿素是反芻畜類(lèi)（牛、羊、駱駝等）動(dòng)物良好的氮源飼料添加劑。這些反芻食草動(dòng)物的胃和腸道內(nèi)具有特殊微生物可分解尿素形成氨，并能夠利用氨作為自身蛋白質(zhì)的氮源[3]。這些微生物可分解人類(lèi)不能分解的植物纖維素為單糖。然而，過(guò)量添加尿素可以產(chǎn)生過(guò)量的氨和二氧化碳，引起中毒死亡。最近幾年，因尿素過(guò)量而導(dǎo)致牛、羊等家畜死亡的意外事件時(shí)有發(fā)生[4-5]。但關(guān)于偶蹄類(lèi)反芻畜類(lèi)的氨中毒數(shù)據(jù)甚少。本研究探討了用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）衍生化技術(shù)對(duì)生物樣品中的氨進(jìn)行快速檢測(cè)的方法。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

Agilent 7890B-5977A氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀（美國(guó)Agilent公司）；HP-5ms（30m×0.25mm，0.25μm）彈性石英毛細(xì)管柱；IKA?VORTEX 2渦旋混勻器（德國(guó)IKA公司）；TG16K-Ⅱ高速離心機(jī)（長(zhǎng)沙東旺實(shí)驗(yàn)儀器有限公司）。

衍生化試劑七氟丁酰氯（98%，美國(guó)Sigma公司）。氨標(biāo)準(zhǔn)溶液（批次編號(hào)：104210；質(zhì)量濃度為500μg/mL；中國(guó)環(huán)境保護(hù)部標(biāo)準(zhǔn)樣品研究所）。提取溶劑乙酸乙酯等有機(jī)溶劑均為色譜純?cè)噭?。二次除氨去離子水（美國(guó)Agilent公司）。

1.2 氣相色譜-質(zhì)譜條件

氣相色譜條件：采用HP-5ms（30 m×0.25 mm，0.25μm）彈性石英毛細(xì)管柱。采用程序升溫：初始柱溫為60℃，保持1 min，以20℃/min升溫至260℃，保持15 min，共計(jì)運(yùn)行26 min。進(jìn)樣口溫度為265℃，不分流進(jìn)樣1μL。載氣為高純氦氣（99.9%），流速為1.0mL/min。

質(zhì)譜條件：采用電子離子轟擊源（EI源，70 eV），離子源溫度為230℃，四極桿溫度為150℃，SIM掃描方式，以m/z166為定量離子，溶劑延遲3min。

1.3 標(biāo)準(zhǔn)樣品的配制

吸取適量標(biāo)準(zhǔn)氨溶液于100mL容量瓶中，用二次去離子水分別稀釋?zhuān)谱髻|(zhì)量濃度為0.005～2 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)氨溶液。

1.4 生物樣品處理

精密稱(chēng)取生物樣品全血0.5 mL或牛瘤胃內(nèi)容物0.5 g于10 mL試管中，加入1 mol/L的NaOH溶液0.5mL。加入七氟丁酰氯衍生化試劑10μL。漩渦振蕩30s后，功率800W微波反應(yīng)1min。加入乙酸乙酯2.0mL振蕩1min，1000×g離心10min，用移液器取出1.5mL上清液至2mL的微量離心管中，濃縮至0.1mL體積后進(jìn)GC-MS檢測(cè)分析。

1.5 方法學(xué)驗(yàn)證

1.5.1 專(zhuān)屬性試驗(yàn)

取正常人新鮮靜脈血0.5 mL以及添加氨標(biāo)準(zhǔn)液至質(zhì)量濃度為0.5μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)添加血漿樣品0.5mL于10 mL試管中，按照“1.4生物樣品處理”方法進(jìn)行處理后，用GC-MS分析，進(jìn)行專(zhuān)屬性考察。

1.5.2 線(xiàn)性與范圍

經(jīng)向0.5mL正常人新鮮靜脈血中添加氨標(biāo)準(zhǔn)液，制備質(zhì)量濃度范圍在0.5～200.0μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)血漿樣品，按照“1.4生物樣品處理”方法進(jìn)行處理后，用GC-MS分析，記錄m/z166衍生化產(chǎn)物離子峰面積。

1.5.3 精密度試驗(yàn)

取正常人新鮮靜脈血0.5mL于10mL試管中，向其中添加氨標(biāo)準(zhǔn)液，制備血氨質(zhì)量濃度分別為1.0、50.0和200.0 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)添加樣品，每個(gè)濃度5份，按照“1.4生物樣品處理”方法進(jìn)行處理后，用GC-MS分析，進(jìn)行日內(nèi)日間精密度考察。

1.6 衍生化條件考察

1.6.1 衍生化pH值考察

取6份正常人新鮮靜脈血各0.5 mL于10 mL試管中，向其中添加氨標(biāo)準(zhǔn)液，制備血氨質(zhì)量濃度為20.0 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)添加樣品。分別加入pH值為9、10、11、12、13、14的NaOH溶液0.5 mL。余步驟按照“1.4生物樣品處理”方法進(jìn)行處理后，用GC-MS分析，記錄衍生化產(chǎn)物的峰面積。

1.6.2 衍生化振蕩時(shí)間考察

取5份正常人新鮮靜脈血各0.5 mL于10 mL試管中，向其中添加氨標(biāo)準(zhǔn)液，制備血氨質(zhì)量濃度為20.0 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)添加樣品。分別加入1 mol/L的NaOH溶液0.5mL，加入七氟丁酰氯衍生化試劑10μL。分別漩渦振蕩 0.5、1、5、10、20 min后。余步驟按照“1.4生物樣品處理”方法進(jìn)行處理后，用GC-MS分析，記錄衍生化產(chǎn)物的峰面積。

1.6.3 衍生化微波反應(yīng)時(shí)間考察

取5份正常人新鮮靜脈血各0.5 mL于10 mL試管中，向其中添加氨標(biāo)準(zhǔn)液，制備血氨質(zhì)量濃度為20.0 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)添加樣品。分別加入1 mol/L的NaOH溶液0.5mL，加入七氟丁酰氯衍生化試劑10μL。漩渦振蕩30s后，使用功率800W進(jìn)行微波反應(yīng)，分別考察反應(yīng)時(shí)間1、2、3、4、5min。剩余步驟按照“1.4生物樣品處理”方法進(jìn)行處理后，用GC-MS分析，記錄衍生化產(chǎn)物的峰面積。

2 結(jié)果與討論

2.1 七氟丁?；难苌a(chǎn)物

氨在堿性條件下與七氟丁酰氯發(fā)生?；磻?yīng)，形成七氟丁酰胺目標(biāo)產(chǎn)物。在反應(yīng)機(jī)制上屬于親核取代反應(yīng)。氨的N原子作為親核試劑進(jìn)攻七氟丁酰氯的羰基。生成的HCl被NaOH中和。衍生化試劑脂肪鏈上的F有助于羰基正碳離子的形成（圖1）。

圖1 七氟丁酰氯與氨的反應(yīng)式Fig.1 The reaction formula of heptafluorobutyryl chloride and ammonia

生成物性質(zhì)穩(wěn)定，極性較小，具有良好的色譜行為。保留時(shí)間3.25min，特征離子為m/z214（分子離子峰）、m/z194、m/z166、m/z146、m/z100、m/z69和m/z44（基峰），其中m/z166為定量離子。該產(chǎn)物質(zhì)譜圖（圖2）與美國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)與技術(shù)研究所（National Institute of Standards and Technology，NIST）質(zhì)譜庫(kù)[6]中七氟丁酰胺譜圖基本一致。

圖2 氨的七氟丁?；馁|(zhì)譜圖Fig.2 Mass spectrum of heptafluorobutyrylation of ammonia

2.2 方法學(xué)驗(yàn)證

2.2.1 專(zhuān)屬性試驗(yàn)

專(zhuān)屬性試驗(yàn)結(jié)果表明，在上述試驗(yàn)條件下內(nèi)源性物質(zhì)不干擾血氨的檢測(cè)。

2.2.2 線(xiàn)性與范圍

以血氨質(zhì)量濃度（x）為橫坐標(biāo)，衍生化產(chǎn)物峰面積（y）為縱坐標(biāo)，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)回歸方程：

如圖3所示，在0.5～200.0 μg/mL范圍內(nèi)獲得了良好的線(xiàn)性關(guān)系。定量限為0.5 μg/mL，檢出限為0.1μg/mL。

圖3 血中添加氨的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)Fig.3 Standard curve of additive ammonia in blood

2.2.3 精密度試驗(yàn)

試驗(yàn)結(jié)果經(jīng)計(jì)算，日內(nèi)精密度相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（relative standard deviation，RSD）范圍 2.59%～3.88%，日間精密度RSD范圍3.21%～3.76%，該方法精密度符合要求（表1）。

表1 血氨樣品的精密度實(shí)驗(yàn)Tab.1 Precision experiment of blood ammonia sample（n=5，%）

2.3 衍生化反應(yīng)條件優(yōu)化

2.3.1 衍生化pH值考察

酰氯和胺反應(yīng)生成酰胺，需要在堿性條件下進(jìn)行，產(chǎn)物中生成氯化氫，加入縛酸劑可提高反應(yīng)效率，本研究對(duì)pH=9以上的堿性條件進(jìn)行了考察。結(jié)果表明，隨著反應(yīng)體系pH的升高，衍生化產(chǎn)物峰面積隨之升高，1mol/L的NaOH溶液（pH=14）最有助于產(chǎn)物的穩(wěn)定（表2）。

表2 衍生化pH值考察Tab.2 Study on pH value of derivatization

2.3.2 衍生化振蕩時(shí)間考察

衍生化反應(yīng)通常預(yù)留出一定的反應(yīng)時(shí)間，加入衍生化試劑后隨即進(jìn)行下一步操作的情況并不多見(jiàn)。本研究對(duì)20min以?xún)?nèi)的衍生化時(shí)間進(jìn)程進(jìn)行了考察，并沒(méi)發(fā)現(xiàn)衍生化產(chǎn)物峰面積明顯提高（表3）。因此，默認(rèn)為衍生化反應(yīng)是瞬間完成的。選擇渦旋振蕩30s作為衍生化振蕩時(shí)間。

表3 衍生化振蕩時(shí)間考察Tab.3 Study on the oscillation time of derivatization

2.3.3 衍生化微波反應(yīng)時(shí)間考察

衍生化產(chǎn)物的峰面積見(jiàn)表4。微波反應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng)并未提高衍生化產(chǎn)物的產(chǎn)率，為節(jié)省反應(yīng)能源，縮短反應(yīng)時(shí)間，選擇功率800W，反應(yīng)時(shí)間1min作為微波反應(yīng)條件。

表4 衍生化微波反應(yīng)時(shí)間考察Tab.4 Study on microwave reaction time of derivatization

2.3.4 衍生化反應(yīng)試劑的選擇

近些年綠色化學(xué)理念逐步興起，以往大量使用的高揮發(fā)性高毒性苯類(lèi)和烷烴類(lèi)有機(jī)提取溶劑逐漸淡出實(shí)驗(yàn)室，轉(zhuǎn)變?yōu)閼?yīng)用少量的酯類(lèi)有機(jī)溶劑進(jìn)行提取。在非衍生化的毒物篩查提取的場(chǎng)合，乙酸乙酯的使用頻率逐漸增加。氨或七氟丁酰胺理論上可以與乙酸乙酯發(fā)生氨解反應(yīng)生成乙酰胺，但是反應(yīng)產(chǎn)物圖譜中并未見(jiàn)乙酰胺的色譜和質(zhì)譜峰。綜合分析，仍然沿用常見(jiàn)毒物篩查使用的乙酸乙酯作為提取溶劑。

2.4 本方法的臨床和法醫(yī)學(xué)應(yīng)用

血氨和尿氨是臨床評(píng)價(jià)非蛋白氮的重要指標(biāo)之一。人血氨濃度的正常值范圍比尿素氮（尿素）低得多，為18～72 μmol/L[7]。換算成法醫(yī)毒物分析常用質(zhì)量單位為306～1 224 ng/mL，上限即約為1.22 μg/mL。肝昏迷患者的血氨值會(huì)大幅度突破上限。臨床上檢測(cè)氨是依據(jù)光譜學(xué)原理，要求靜脈血新鮮且不能溶血。本方法可以作為臨床現(xiàn)有方法的補(bǔ)充或佐證。在法醫(yī)毒物分析領(lǐng)域中可以追溯死者生前的肝腎功能狀況，輔助確證死亡原因。

2.5 本方法在畜類(lèi)生物樣品中的應(yīng)用

目前，牛、羊等家畜尿素中毒死亡的案件量明顯上升。大型哺乳動(dòng)物與人類(lèi)有相似的尿素循環(huán)通路，尿素循環(huán)是以合成和排泄尿素為主的，尿素進(jìn)入牛的瘤胃后，其中微生物群產(chǎn)生的脲酶將其分解為氨和二氧化碳，部分氨經(jīng)瘤胃、網(wǎng)胃壁吸收，再經(jīng)肝形成尿素，隨尿液排出體外，或返回瘤胃或分泌于唾液中去。部分氨轉(zhuǎn)化為氨基酸，進(jìn)而合成菌體蛋白質(zhì)，作為自身消化、吸收和利用的蛋白質(zhì)來(lái)源。當(dāng)尿素超量，分解成氨的速度加快，導(dǎo)致氨在瘤胃內(nèi)大量蓄積，而被吸收進(jìn)入血液，即可發(fā)生氨中毒，導(dǎo)致機(jī)體的器質(zhì)和功能性損傷[8]。有文獻(xiàn)[9]報(bào)道：牛血氨正常值約為6μg/mL，空腹瘤胃內(nèi)容物氨含量約為75μg/g；氨中毒時(shí)血氨含量可達(dá)10μg/mL，瘤胃內(nèi)容物中氨含量可達(dá)700～1 000 μg/g，若同時(shí)瘤胃內(nèi)容物pH值大于8即可確診。

案例應(yīng)用：2016年4月，遼寧某縣發(fā)生農(nóng)戶(hù)家養(yǎng)黃牛不明原因死亡案件。經(jīng)過(guò)當(dāng)?shù)孬F醫(yī)檢查后將其血液委托我鑒定中心進(jìn)行毒物檢測(cè)。經(jīng)血液生化檢測(cè)，測(cè)得牛血清尿素含量為16 mmol/L。應(yīng)用本文方法測(cè)得牛血氨為91μg/mL，確定該牛為氨中毒。

綜上所述，在臨床檢驗(yàn)中血氨一直是評(píng)價(jià)肝腎功能的常規(guī)檢測(cè)項(xiàng)目。然而，由于臨床的檢驗(yàn)方法均是以光譜法為基礎(chǔ)的，在遇到血液樣品溶血、結(jié)塊，形態(tài)復(fù)雜時(shí)，或胃內(nèi)容物等復(fù)雜的生物基質(zhì)時(shí)容易引入誤差。因此，有必要開(kāi)發(fā)測(cè)定血氨和生物樣品中氨的GC-MS方法。用色譜法測(cè)定氨，早期是應(yīng)用分子篩等填充柱的吸附色譜方法，但由于氨為氣體，極性強(qiáng)，在柱內(nèi)嚴(yán)重?cái)U(kuò)散達(dá)不到相應(yīng)的最低檢測(cè)限[10]。本研究嘗試了在樣品中直接用七氟丁酰氯衍生化后經(jīng)過(guò)常規(guī)提取進(jìn)行氨的快速檢測(cè)，對(duì)臨床檢測(cè)血氨和毒物分析領(lǐng)域中確定死者生前的肝功能狀況及反芻偶蹄類(lèi)動(dòng)物（牛、羊和駱駝等）的氨中毒鑒定具有重要意義。