李 靜，付曉瑞，孫振昌，張明智

(鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院腫瘤科，河南 鄭州 450052)

自然殺傷細(xì)胞/T細(xì)胞淋巴瘤(natural killer/T cell lymphoma, NKTCL)是一種高度侵襲性淋巴瘤，約占非霍奇金淋巴瘤的5%～18%[1-3]，以結(jié)外病變?yōu)橹鳎们旨氨腔蛎嬷芯€部，并伴有組織壞死和血管侵襲，為進(jìn)行性、破壞性病變[4]。腫瘤細(xì)胞具有細(xì)胞毒性，表達(dá)CD56、CD2、CD3ε和CD30等。流行病學(xué)調(diào)查示，NKTCL的發(fā)病具有明顯的地域分布，亞洲及拉丁美洲較歐、美國(guó)家明顯多發(fā)，中位發(fā)病年齡為44～55歲，其發(fā)病機(jī)制尚不明確，可能與EB病毒感染具有高度相關(guān)性。對(duì)于NKTCL，國(guó)際上尚未出現(xiàn)統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)的化療方案，其化療敏感性低，預(yù)后差，生存期短，早期治療常以單獨(dú)放療或聯(lián)合化療為主，進(jìn)展期以化療為主，部分患者可獲短暫緩解卻極易復(fù)發(fā)，造血干細(xì)胞移植并不能改善NKTCL患者預(yù)后。

局限期(Ann Arbor分期Ⅰ、Ⅱ期)NKTCL對(duì)放療較為敏感，但緩解期短，約一半患者短期內(nèi)復(fù)發(fā)，縱然接受放化療聯(lián)合治療，5 a生存率也只有約50%；而對(duì)于晚期或進(jìn)展期(Ann Arbor分期Ⅲ、Ⅳ期)患者，常規(guī)予以蒽環(huán)類(lèi)藥物為基礎(chǔ)的治療方案，但療效不佳，腫瘤細(xì)胞高表達(dá)P-糖蛋白導(dǎo)致其對(duì)蒽環(huán)類(lèi)藥物耐藥[5]。無(wú)論是美國(guó)NCCN指南還是歐洲ESMO指南均推薦以門(mén)冬酰胺酶為基礎(chǔ)的方案，其顯著改善了臨床療效。即便如此，每年仍有相當(dāng)一部分患者出現(xiàn)耐藥或復(fù)發(fā)，5 a生存率低于30%。對(duì)此類(lèi)人群迫切需要新的治療方法[6-8]。

血液惡性腫瘤具有高侵襲性和預(yù)后不良等特征，長(zhǎng)期以來(lái)治療效果并不令人滿(mǎn)意[9-10]，隨著對(duì)疾病認(rèn)識(shí)的深入，越來(lái)越多靶向藥物和免疫治療手段的應(yīng)用為這些疾病的治療帶來(lái)一線曙光，尤其是嵌合抗原受體T(CAR-T)細(xì)胞治療近年來(lái)取得了令人矚目的效果。然而單克隆抗體藥物和CAR-T細(xì)胞治療取得非凡的臨床療效的同時(shí)，也增加了對(duì)藥物安全性評(píng)估的要求。本研究利用標(biāo)準(zhǔn)免疫組化技術(shù)檢測(cè)CD38與非靶器官的結(jié)合，可為臨床藥物監(jiān)測(cè)毒性提供參考。此外，檢測(cè)NKTCL中CD38的表達(dá)探討其作為免疫治療靶標(biāo)的可能性。

1 材料與方法

1.1 材料來(lái)源本研究收集鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院病理科存檔的209例標(biāo)本，包括169例不同部位正常組織、20例NKTCL組織、20例淋巴結(jié)增生組織。所有組織均經(jīng)40 g/L甲醛固定并包埋在石蠟中。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)免疫組化技術(shù)檢測(cè)CD38方法所有切片均為連續(xù)切片，經(jīng)梯度乙醇脫蠟、水化，根據(jù)說(shuō)明書(shū)使用S-P試劑盒(北京天根生化科技有限公司)進(jìn)行了免疫組化染色，檢測(cè)CD38蛋白在不同組織中的表達(dá)和定位。結(jié)果由2位經(jīng)驗(yàn)豐富的病理科醫(yī)生進(jìn)行評(píng)估。對(duì)陽(yáng)性細(xì)胞的百分比評(píng)分如下：0分為陰性表達(dá)，陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)<5%；1分為弱陽(yáng)性，陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)5%～<25%；2分為中度陽(yáng)性，陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)25%～<50%；3分為強(qiáng)陽(yáng)性，陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)≥50%。

1.3 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)CD38方法使用含體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清和青霉素(1 000 u/mL)/鏈霉素(10 μg/mL)的RPMI-1640培養(yǎng)基(美國(guó)Gbico公司)培養(yǎng)NKTCL細(xì)胞系。以1 000 r/min速度離心細(xì)胞5 min，加入100 μL磷酸鹽緩沖液(PBS)，然后在4 ℃下用CD38抗體(美國(guó)BD公司)或同型對(duì)照抗體對(duì)表面染色15 min；之后用PBS洗3遍樣品并用FACS緩沖液重懸于流式管中，然后使用FACS Canto流式細(xì)胞儀(美國(guó)BD公司)進(jìn)行上機(jī)收集數(shù)據(jù)。使用FlowJo V10(美國(guó)FlowJo公司)進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。NKTCL細(xì)胞系中CD38表達(dá)評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)為：陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)超過(guò)陰性對(duì)照百分比≥80%為陽(yáng)性，10%～<80%為部分表達(dá)，<10%為陰性。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS 21.0進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，CD38在NKTCL組織和增生淋巴結(jié)組織中的表達(dá)比較用秩和檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 CD38在不同組織中的表達(dá)169例不同解剖部位的正常組織中，CD38在脾、精囊腺、扁桃體、輸卵管和乳腺組織中呈現(xiàn)廣泛的強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)，在前列腺、肺、膀胱、腎和直腸組織中顯示不同程度的陽(yáng)性表達(dá)，其余組織中CD38陰性表達(dá)。在人類(lèi)蛋白質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫(kù)(https://www.proteinatlas.org/)中搜索發(fā)現(xiàn)，CD38僅在前列腺、精囊腺、淋巴結(jié)和扁桃體中強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)，而在闌尾、脾和骨髓中弱陽(yáng)性表達(dá)。這與我們結(jié)果中CD38在脾、精囊腺和扁桃體中的強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)基本相吻合。輸卵管和乳腺作為女性生殖系統(tǒng)也呈強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)，表明CD38可能在生殖系統(tǒng)中高表達(dá)。肺、膀胱、腎和直腸的陽(yáng)性表達(dá)可能是由于炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)引起CD38的高表達(dá)，該結(jié)果也可能與人種差異有關(guān)?？傊?，我們對(duì)CD38表達(dá)的免疫組化研究結(jié)果與數(shù)據(jù)庫(kù)研究結(jié)果高度吻合。見(jiàn)表1、圖1。

表1 不同組織中CD38蛋白表達(dá)

2.2 CD38在NKTCL和增生淋巴結(jié)組織中的表達(dá)NKTCL組織(強(qiáng)陽(yáng)性8例，中度陽(yáng)性6例，弱陽(yáng)性2例，陰性4例)中CD38表達(dá)高于增生淋巴結(jié)組織(強(qiáng)陽(yáng)性0例，中度陽(yáng)性10例，弱陽(yáng)性2例，陰性8例)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Z=2.394，P=0.017)。NKTCL細(xì)胞系中CD38也顯示高表達(dá)，其中NKL和YT細(xì)胞系中陽(yáng)性表達(dá)，NKYS細(xì)胞系中部分表達(dá)，而KHYG-1細(xì)胞系中陰性表達(dá)。提示CD38可能是NKTCL的免疫治療靶標(biāo)。見(jiàn)圖1、2。

圖1 不同組織中CD38的表達(dá)

3 討論

CD38是Ⅱ型跨膜糖蛋白，具有酶活性，可催化環(huán)腺苷二磷酸核糖的合成與降解，在細(xì)胞鈣離子平衡調(diào)控中起重要作用。此外，CD38與配體CD31相互作用，在調(diào)節(jié)細(xì)胞遷移、受體介導(dǎo)的黏附以及信號(hào)傳導(dǎo)中也扮演著重要角色。在許多造血系統(tǒng)的惡性腫瘤(如非霍奇金淋巴瘤、多發(fā)性骨髓瘤[11]、Waldenstr?m巨球蛋白血癥[12]、急性粒細(xì)胞白血病[13]和慢性淋巴細(xì)胞白血病)中，CD38的表達(dá)均有上調(diào)。此外，CD38還可以在幾種造血細(xì)胞中表達(dá)，包括自NK細(xì)胞、單核細(xì)胞以及部分T細(xì)胞和B細(xì)胞[14]。在某些免疫抑制細(xì)胞(如髓源性抑制細(xì)胞、調(diào)節(jié)性T細(xì)胞、調(diào)節(jié)性B細(xì)胞和某些NK細(xì)胞亞型)中也出現(xiàn)CD38蛋白表達(dá)。CD38-煙酰胺腺嘌呤二核苷酸信號(hào)通路可以促進(jìn)這些免疫抑制細(xì)胞的活性，并與抑制性腫瘤微環(huán)境的形成有關(guān)，間接促進(jìn)腫瘤的免疫逃逸[15-19]。

CD38的表達(dá)使其成為治療性抗體藥物的開(kāi)發(fā)靶點(diǎn)。目前，現(xiàn)已有daratumumab和isatuximab等2種CD38單抗獲批上市，適應(yīng)證均為多發(fā)性骨髓瘤。CD38單抗主要通過(guò)補(bǔ)體依賴(lài)性細(xì)胞毒性反應(yīng)和抗體依賴(lài)性細(xì)胞毒性反應(yīng)等抗體Fc片段介導(dǎo)的免疫機(jī)制殺傷腫瘤細(xì)胞，并可誘發(fā)抗體依賴(lài)性吞噬和腫瘤細(xì)胞凋亡。此外，CD38抗體還可以拮抗調(diào)節(jié)性T細(xì)胞和調(diào)節(jié)性B細(xì)胞介導(dǎo)的免疫抑制，從而整體激活機(jī)體的免疫反應(yīng)。

CD38在NKTCL組織中的高表達(dá)使得其可能作為治療靶點(diǎn)被作用。本文結(jié)果也證實(shí)，NKTCL組織中CD38表達(dá)高于增生淋巴結(jié)組織。一項(xiàng)回顧性研究[20]表明，在94例NKTCL患者中，只有5%的患者CD38陰性表達(dá)，超過(guò)50%的患者強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)，且CD38的高表達(dá)與預(yù)后不良相關(guān)。而daratumumab單藥治療復(fù)發(fā)、難治性NKTCL的臨床試驗(yàn)研究(NCT02927925)結(jié)果顯示，在32例患者中50%的患者CD38表達(dá)≥50%，客觀緩解率為25.0%，中位隨訪時(shí)間為16.7個(gè)月，一些患者實(shí)現(xiàn)了腫瘤縮小和EB病毒負(fù)荷降低，但沒(méi)有患者達(dá)到完全緩解。在血液學(xué)毒性中，最常見(jiàn)的是血小板減少、貧血、白細(xì)胞減少和中性粒細(xì)胞減少[21]?；A(chǔ)研究同樣發(fā)現(xiàn)，daratumumab能有效裂解高表達(dá)CD38的NKTCL，此外還發(fā)現(xiàn)L-天冬酰胺酶與daratumumab聯(lián)合使用對(duì)CD38高表達(dá)NKTCL細(xì)胞具有協(xié)同的細(xì)胞毒性作用[22]?？傮w而言，作為NKTCL的新治療靶標(biāo)，CD38單抗仍處于探索性研究階段，與其他藥物聯(lián)合治療可能帶來(lái)更好的療效。

腫瘤組織高表達(dá)、正常組織低表達(dá)也使CD38可能成為CAR-T細(xì)胞治療的靶標(biāo)。Mihara等[23]通過(guò)體外和體內(nèi)研究發(fā)現(xiàn)，CD38 CAR-T細(xì)胞可以有效裂解耐藥的非霍奇金淋巴瘤細(xì)胞。他們隨后證實(shí)，CD38 CAR-T細(xì)胞可以靶向具有多重耐藥性的多發(fā)性骨髓瘤患者的腫瘤細(xì)胞和多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞系，并且在動(dòng)物模型中觀察到同樣的現(xiàn)象[24]。CD38 CAR-T細(xì)胞治療復(fù)發(fā)、難治性多發(fā)性骨髓瘤的臨床試驗(yàn)也在開(kāi)展，但CAR-T細(xì)胞重要的不良反應(yīng)之一脫靶效應(yīng)值得人們重視。因此在CD38 CAR-T細(xì)胞的設(shè)計(jì)中，研究人員應(yīng)考慮雙靶聯(lián)合或使用可控開(kāi)關(guān)以避免對(duì)非靶標(biāo)器官的損傷。在臨床應(yīng)用中，還應(yīng)考慮檢測(cè)非靶器官的特異指標(biāo)，以便早期發(fā)現(xiàn)損傷。

盡管daratumumab在復(fù)發(fā)、難治性多發(fā)性骨髓瘤中顯示出較好的療效，但仍存在一些不容忽視的不良反應(yīng)。無(wú)論是daratumumab單藥治療還是聯(lián)合治療多發(fā)性骨髓瘤的臨床試驗(yàn)中，最常見(jiàn)的不良事件是與輸液相關(guān)的反應(yīng)。此外，超過(guò)Ⅲ度的嚴(yán)重不良反應(yīng)包括貧血、中性粒細(xì)胞減少、血小板減少、肺炎、上呼吸道感染和高血壓[25-28]。在臨床試驗(yàn)GEN501、CASTOR 和POLLUX研究中觀察到肺炎的發(fā)生率分別為7%、8%和8%，可能與本研究發(fā)現(xiàn)的肺組織存在CD38陽(yáng)性表達(dá)密切相關(guān)。這提示臨床醫(yī)生使用CD38單抗治療血液系統(tǒng)腫瘤時(shí)，應(yīng)關(guān)注CD38高表達(dá)組織可能產(chǎn)生的損傷反應(yīng)。

綜上所述，CD38在各組織中表達(dá)有限，在NKTCL組織中高表達(dá)，可以作為免疫治療靶標(biāo)。靶向CD38治療時(shí)，臨床醫(yī)生應(yīng)考慮到對(duì)高表達(dá)CD38的非靶器官造成的可能損害。該研究可為臨床藥物安全性提供參考，并幫助臨床醫(yī)生警惕高表達(dá)組織的損傷或不良反應(yīng)，進(jìn)行針對(duì)性的提前預(yù)防。此外，該研究結(jié)論可能為使用CD38作為免疫治療靶標(biāo)提供背景支持。