郭秀霞,程鵬,劉麗娟,王海防,王懷位,張崇星

蚊蟲是重要的醫(yī)學(xué)昆蟲，除吸血騷擾人類外，還是瘧疾、登革熱、乙型腦炎等重要傳染病的傳播媒介。全世界已知蚊蟲共41屬201亞屬3 773種，由于隱存種的廣泛存在，實(shí)際種數(shù)應(yīng)是已定名種數(shù)的3～5倍[1，2]。開展蚊媒種屬遺傳變異研究和分子鑒別對于蚊媒疾病的防治具有重要意義。目前常用于蚊蟲種屬分類方法主要有形態(tài)學(xué)鑒定和分子鑒定，其中多拷貝的核糖體DNA是在蚊蟲近緣種的鑒別和系統(tǒng)關(guān)系分析中應(yīng)用較為成功和理想的分類指標(biāo)[3]。研究表明，蚊蟲rDNA 單位有18S、5.8S、28S RNA編碼區(qū)、基因間隔區(qū)(ICS)、第l 和第2轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(ITSl、ITS2)、外轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(EST)組成，編碼區(qū)和間隔區(qū)的進(jìn)化速率不同，在親緣關(guān)系密切的種間，編碼區(qū)的序列高度保守，而非編碼區(qū)如基因間隔區(qū)和內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)的序列存在差異，其中ITS區(qū)不加入成熟核糖體，受到選擇壓力小，進(jìn)化的速率較快，因此可以從其序列中得到較多的信息[4]。本研究對山東省濟(jì)寧市9種常見蚊蟲rDNA-ITS2基因序列進(jìn)行分子鑒定，為今后蚊蟲種類分子鑒定方法探討提供依據(jù)。

材料與方法

1材料

1.1蚊蟲樣本2017年7月中旬采用傳統(tǒng)的蚊媒密度監(jiān)測方法人餌帳誘捕蚊法在山東省濟(jì)寧市北湖地區(qū)采集成蚊樣本，采集的蚊蟲帶回實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行形態(tài)學(xué)鑒定。

1.2試劑與設(shè)備dNTP、LA Taq聚合酶、DNA分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)(DL-2000、1kbp Ladder)購自日本TaKaRa 公司。PCR 產(chǎn)物純化試劑盒購于美國Axygen公司。T-Gradient Thermoblock PCR擴(kuò)增儀購于德國Biometra 公司，Mini-ProteanTetra Cell 電泳儀和Smart Spec3000紫外分光光度計(jì)購于美國Bio-Rad公司。

2方法

2.1成蚊采集采用人餌帳誘捕蚊法，在室外懸掛單人蚊帳，固定四角，使帳下緣距離地面20～30 cm，傍晚及日落后15 min由一人于帳內(nèi)開始誘捕蚊蟲，每小時(shí)捕蚊45 min，至次日黎明止。形態(tài)學(xué)鑒定方法按照相關(guān)參考文獻(xiàn)[5，6]進(jìn)行。

2.2蚊蟲基因組DNA 提取按相關(guān)文獻(xiàn)[7]操作步驟，提取單蚊基因組DNA。將單個(gè)蚊蟲置于1.5mL離心管中，加入100μL 預(yù)熱的裂解液，用塑料研磨棒研磨至勻漿狀。65℃孵育30 min，加5 mol/L(25μL)乙酸鉀至終濃度1 mol/L，混勻，4℃置30 min。13 200 r/min(離心半徑10 cm)離心10 min。取上清液100～110μL，注意不要抽到沉淀。加2～2.5倍體積預(yù)冷無水乙醇(-20℃)沉淀核酸，4℃靜置30 min～3 h，13 200 r/min(離心半徑10 cm)離心10 min。棄上清液，加75%乙醇200 ～300μL(-

4℃)洗滌鹽分，棄上清液，37℃烘干。加50～100 μL 雙蒸滅菌水溶解，置-20℃冰箱保存待用。紫外分光光度計(jì)測DNA濃度及純度，1%瓊脂糖凝膠電泳分析。

2.3 rDNA-ITS2基因的擴(kuò)增與測序根據(jù)蚊蟲rDNA-ITS2序列特征，在相對保守區(qū)域設(shè)計(jì)引物，引物由上海Invitrogen 貿(mào)易有限公司合成。上游引物:5'-GAACTGCAGGACACATGA-3'，與淡色庫蚊28S前端編碼區(qū)保守序列互補(bǔ)；下游引物:5'-GGGGTAGTCACACATTATTTG-3'，與淡色庫蚊5.8S末端編碼區(qū)保守序列互補(bǔ)。以提取的蚊蟲DNA為模板，用上述引物進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。采用50μL 反應(yīng)體系:

ddH2O 38.5μL、10×LA PCR Buffer 5μL、10mmol/L dNTP 1μL、模板DNA 1μL、LA Taq聚合酶0.5 μL、10 pmol/L 上下游引物各2μL。反應(yīng)條件:94℃預(yù)變性3 min，94℃變性30 s，55℃退火45 s，72℃延伸1 min，共30個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸5 min。取擴(kuò)增產(chǎn)物5μL 進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳，凝膠成像系統(tǒng)觀察拍照記錄結(jié)果。擴(kuò)增成功樣品送Invitrogen公司進(jìn)行雙向測序。

2.4數(shù)據(jù)分析采用Bioedit 7.0 軟件對測序結(jié)果進(jìn)行拼接處理，正反鏈序列結(jié)果一致的樣本進(jìn)行下一步分析。登陸GenBank 對序列進(jìn)行Blast 同源性比對，不同個(gè)體rDNA-ITS2 序列用DNAMAN軟件進(jìn)行 序 列 比 對，用DNASTAR、ClustalX 1.81和Mega6軟件進(jìn)行序列分析。基于遺傳距離Kimura 2-parameter 采用NJ法和UPGMA法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，系統(tǒng)樹各分支的置信度由1 000次bootstrap重復(fù)檢測。

結(jié)果

1成蚊種類

共捕獲蚊蟲6 屬9種4 267只，其中淡色庫蚊(Culexpipienspallens)2 954只、三帶喙庫蚊(Culex tritaeniorhynchus)563只、二帶喙庫蚊(Culexbitaeniorhynchus)9只、刺擾伊蚊(Aedesvexans)5只、白紋伊蚊(Aedesalbopictus)38只、中華按蚊(Anopheles sinensis)463只、騷擾阿蚊(Armigeresobturbans)22只、黃色軻蚊(Coquillettidiaochracea)12 只和常型曼蚊(Mansoniauniformis)201只。

2蚊蟲rDNA-ITS2基因克隆

9種蚊蟲rDNA-ITS2 基因片段長度為200 bp與750 bp之間(圖1)。

圖1 9種蚊種的rDNA-ITS2基因PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果

3 rDNA-ITS2 基因測序及序列分析

9種蚊蟲的rDNA-ITS2基因片段長度在343 bp與577 bp之間，其中，中華按蚊的基因片段最長(577 bp)，黃色柯蚊的基因片段最短(343 bp)，淡色庫蚊、二帶喙庫蚊、三帶喙庫蚊、白紋伊蚊、刺擾伊蚊、騷擾阿蚊、常型曼蚊的基因片段長度分別為:446 bp、371 bp、377 bp、489 bp、352 bp、387 bp、366 bp，所有序列均未發(fā)現(xiàn)堿基插入或缺失。rDNA-ITS2 基因片段中A、C、G、T 四種堿基的平均含量分別為26.2%、26.5%、24.4%、22.8%。A+T 堿基含量范圍為46.0%～54.6%，平均49.0%。各蚊種A+T 堿基含量見表1。rDNA-ITS2 基因片段585個(gè)位點(diǎn)中有59個(gè)保守位點(diǎn)，449個(gè)變異位點(diǎn)，235個(gè)簡約信息位點(diǎn)，191個(gè)單態(tài)位點(diǎn)。不同蚊種的rDNA-ITS2 序列同源性為28.21%～53.76%，其中庫蚊屬內(nèi)(淡色庫蚊、三帶喙庫蚊、二帶喙庫蚊)同源性為38.85%～66.49%，伊蚊屬內(nèi)(白紋伊蚊、刺擾伊蚊)同源性為40.76%，中華按蚊和二帶喙庫蚊的同源性最低(28.21%)?；贙imura-2 參數(shù)法計(jì)算種間遺傳距離，不同種群的遺傳距離在0.240 ～1.154 之間。中華按蚊和二帶喙庫蚊之間的遺傳距離最大，為1.154，淡色庫蚊和三帶喙庫蚊之間的遺傳距離最小，為0.240，屬間遺傳距離最小的為黃色柯蚊和白紋伊蚊，為0.428(表2)。

采用NJ法和UPGMA法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，所有系統(tǒng)數(shù)樹支上數(shù)值為1 000次Bootstrap檢測得到的對該支的支持百分?jǐn)?shù)。從圖中可以看出這兩種不同的分子系統(tǒng)樹具有大致相同的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)，庫蚊屬的淡色庫蚊、三帶喙庫蚊和二帶喙庫蚊聚成一類，伊紋屬的白紋伊蚊和刺擾伊蚊聚成一類，但這兩個(gè)系統(tǒng)中，騷擾阿蚊、黃色柯蚊、常型曼蚊和中華按蚊的位置有所不同。在NJ樹中，該四種蚊蟲為獨(dú)立分支，而UPGMA 樹中，騷擾阿蚊和黃色柯蚊聚為一類(圖2)。

表1 9蚊種的rDNA-ITS2基因片段堿基組成(%)

表2 9蚊種rDNA-ITS2基因序列的遺傳距離

圖2基于rDNA-ITS2基因序列構(gòu)建的分子系統(tǒng)樹(重復(fù)次數(shù)為1 000 次)

討論

蚊蟲隸屬于節(jié)肢動(dòng)物門、昆蟲綱、雙翅目，長角亞目蚊科，能夠傳播多種疾病，不同種的蚊蟲能夠攜帶和傳播不同的病原體，是嚴(yán)重危害人類健康的重要昆蟲。在蚊蟲分類中，長期以來都是以形態(tài)特征作為分類依據(jù)，而利用形態(tài)特征進(jìn)行分類具有一定的局限性，比如復(fù)合體和親緣種的存在，以及現(xiàn)場采集蚊蟲過程中造成的足斷翅破、損毛失鱗等標(biāo)本形態(tài)特征信息量不足等，使得單純的形態(tài)分類難以進(jìn)行。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的迅猛發(fā)展，出現(xiàn)了線粒體DNA、核糖體DNA、微衛(wèi)星DNA、單核苷酸多態(tài)性(SNP)和限制性片段長度多態(tài)性(RFLP)、隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性(RAPD)等多種分子遺傳標(biāo)記[8，9]。多拷貝的核糖體DNA是細(xì)胞核內(nèi)編碼rDNA的基因，以串聯(lián)多拷貝的形式組成的多基因家族，其種間變異明顯大于種內(nèi)變異。每個(gè)拷貝由編碼區(qū)和間隔區(qū)組成，兩者的進(jìn)化速率不同，在親緣關(guān)系密切的種間，編碼區(qū)高度保守，而非編碼區(qū)序列多態(tài)性程度高，此外，rDNA分子量大小適中，信息量大，因此是蚊蟲近緣種鑒別和序列分析的理想標(biāo)志之一。rNDAITS2在生物界存在普遍性和多拷貝性，在個(gè)體和群體內(nèi)具有較好的均一性，少量樣本能有效代表群體的變異情況，是生物系統(tǒng)進(jìn)化研究的一個(gè)非常有用的分子標(biāo)志[10，11]。本實(shí)驗(yàn)室曾成功分析山東多個(gè)地區(qū)淡色庫蚊的rDNA-ITS2基因多態(tài)性[12]。高琪等[13]利用rDNA-ITS2 基因?qū)湛舶次脧?fù)種團(tuán)內(nèi)的中華按蚊、嗜人按蚊、雷氏按蚊和八代按蚊等4種近緣種進(jìn)行鑒別，結(jié)果符合率達(dá)100%，較傳統(tǒng)按蚊形態(tài)學(xué)鑒別方法更準(zhǔn)確，特異性更高。師永霞等[14]利用rDNA-ITS2 對廣東國境口岸的致倦庫蚊、三帶喙庫蚊、白紋伊蚊、騷擾阿蚊和中華按蚊進(jìn)行分子鑒定，成功對蚊蟲的亞科、屬和種進(jìn)行區(qū)分。

目前，蚊蟲復(fù)合體成員種分子鑒別研究中應(yīng)用rDNA 作為分類指標(biāo)較多，大多數(shù)以ITS2為依據(jù)。本研究以濟(jì)寧市采集的成蚊為材料，經(jīng)過實(shí)驗(yàn)室傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)鑒定為6屬9種。設(shè)計(jì)特異性引物PCR擴(kuò)增成功獲得rDNA-ITS2基因序列并進(jìn)行序列分析。9種蚊蟲的rDNA-ITS2 基因片段長度不同，同源性比較表明，不同蚊種的rDNA-ITS2 序列之間同源性為28.21%～53.76%，種間序列差異性高達(dá)46.24%～71.79%，這表明rDNA-ITS2 序列特征在種間具有一定差異，與師永霞等[14]的研究結(jié)果相一致。淡色庫蚊和三帶喙庫蚊的同源性最高，中華按蚊和二帶喙庫蚊的同源性最低，遺傳距離也同樣顯示淡色庫蚊和三帶喙庫蚊的遺傳距離最小，中華按蚊和三帶喙庫蚊之間的遺傳距離最大。rDNA-ITS2基因的屬間最小遺傳距離0.428和種間最大遺傳距離0.415接近。為了提高結(jié)果的可靠性，在分子系統(tǒng)發(fā)育研究中，通常同時(shí)合用多種方法構(gòu)建系統(tǒng)樹。本研究采用了NJ法和UPGMA法分別構(gòu)樹，并通過1 000次重抽樣(bootstrap)來評(píng)估結(jié)果的可靠性。結(jié)果表明兩種系統(tǒng)樹均能區(qū)分較低分類階元(屬和種)的區(qū)分，但對各屬間系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系的區(qū)分有一定限制，其中NJ樹的結(jié)構(gòu)與與傳統(tǒng)蚊蟲形態(tài)學(xué)分類結(jié)果更為一致。然而，這與此前本實(shí)驗(yàn)室[15]利用線粒體DNA細(xì)胞色素C氧化酶亞基Ⅰ(mtDNA-COⅠ)基因?qū)υ?種蚊蟲進(jìn)行分子進(jìn)化分析的結(jié)果并不一致，但基于rDNA-ITS2 的系統(tǒng)進(jìn)化樹表明，不同屬種的蚊蟲更明顯位于對應(yīng)的聚類分支上。因此，rDNA-ITS2基因可用于蚊蟲分類鑒定，進(jìn)一步的研究將對rDNA-ITS2氨基酸序列進(jìn)行比較分析，同時(shí)綜合利用多種分子遺傳標(biāo)記進(jìn)行鑒定分析比較，彌補(bǔ)蚊蟲傳統(tǒng)分類系統(tǒng)的缺點(diǎn)，為蚊蟲分類鑒別提供依據(jù)。