馬榮,劉麗娟

淡色庫蚊是重要的疾病傳播媒介，可傳播班氏絲蟲病以及流行性乙型腦炎等蚊媒傳染病，在中國主要分布于長江以北地區(qū)[1，2]，以雌成蚊滯育越冬，越冬期從10 月中下旬開始到第二年3月中旬結(jié)束[3]。越冬蚊不僅在媒介蚊蟲種群延續(xù)中發(fā)揮著重要的作用，而且可作為病原體的宿主，解除滯育后，仍然具有較高的傳播能力，間接延長蚊媒病毒的傳播周期[4-6]。淡色庫蚊是變溫動(dòng)物，其生長發(fā)育易受外界環(huán)境條件的影響，對于越冬代蚊蟲來說，冬季低溫是影響種群延續(xù)發(fā)展的重要因素之一。在長期的進(jìn)化過程中，媒介蚊蟲應(yīng)對低溫環(huán)境產(chǎn)生了一系列的應(yīng)對措施，對外尋找隱蔽場所躲避低溫，對內(nèi)改變物質(zhì)組成應(yīng)對低溫的迫害[7-9]。研究發(fā)現(xiàn)，蛋白質(zhì)在昆蟲的滯育和越冬過程中發(fā)揮了重要的作用[10，11]，因此，研究低溫脅迫對淡色庫蚊體內(nèi)蛋白質(zhì)的影響，有助于探索淡色庫蚊的抗寒機(jī)制。本研究以室內(nèi)飼養(yǎng)淡色庫蚊為對照，利用雙向電泳技術(shù)，對低溫處理后淡色庫蚊體內(nèi)蛋白質(zhì)表達(dá)譜進(jìn)行分析，比較低溫脅迫下，淡色庫蚊體內(nèi)蛋白質(zhì)表達(dá)譜的差異，有望獲得淡色庫蚊的抗凍蛋白，為淡色庫蚊越冬抗寒機(jī)制的研究提供數(shù)據(jù)支持。

材料和方法

1試驗(yàn)蚊蟲

試驗(yàn)用淡色庫蚊由山東省寄生蟲病防治研究所醫(yī)學(xué)昆蟲學(xué)部提供。幼蟲飼養(yǎng)條件:溫度26℃±2℃，光周期為光照:黑暗=12L ∶12D，飼喂酵母粉和豬肝粉的混合飼料(1∶1)，成蚊羽化后飼喂5%的葡萄糖水。隨機(jī)挑選部分雌成蚊作為處理組，轉(zhuǎn)入溫度10℃±2℃，相對濕度70%～80%的生化培養(yǎng)箱中飼養(yǎng)48 h后用于試驗(yàn)，未做處理的雌成蚊為對照組。

2試劑和儀器

IPG 膠條(GE公司)，非干擾型蛋白質(zhì)濃度測定試劑盒(SK3071)、昆蟲蛋白提取試劑盒(786-360)、2D電泳樣品清潔試劑(786-124)、質(zhì)譜銀染試劑盒(BSP021)、蛋白質(zhì)快速染色試劑盒(SK3011)、考馬斯亮藍(lán)(G-250)、硝酸銀、溴酚藍(lán)、低熔點(diǎn)瓊脂糖、分析純無水乙醇、乙酸、氨水、甲醛等均為生工生物產(chǎn)品；SDS、GLYCINE、TRIS、ACRYMIDE、BIS、GLYCEROL APS、TEMED(BIO-RAD)、Urea、Thiourea、CHCA為Sigma 產(chǎn)品，乙腈、三氟乙酸為Merck 產(chǎn)品。

分光光度儀(UV1800，美譜達(dá)儀器公司)，純水裝置(摩爾公司)，超聲細(xì)胞破碎儀(浙江新芝)，電泳儀(SE-600全套電泳設(shè)備、光密度掃描儀、冷卻水循環(huán)系統(tǒng)、軟件分析:ImageMasterTM 7.0(GE公司)，質(zhì)譜儀(4800 Plus MALDI TOF/TOFTM Analyzer)(Applied Biosystems，USA)。

3蛋白質(zhì)的提取和濃度測定

淡色庫蚊蛋白質(zhì)提取方法參照昆蟲蛋白提取試劑盒(786-360)。隨機(jī)挑選處理組(A)和對照組(B)淡色庫蚊雌成蚊各100只，稱重，液氮研磨15 min，根據(jù)每100 mg 蚊蟲組織對應(yīng)500μL 的比例加入蛋白提取液，混勻后振蕩20 min，12 000 g 離心10 min，取上清即為昆蟲總蛋白。處理組和對照組均重復(fù)三次。樣品溶液利用Perfect-FOCUSTM 2D電泳樣品清潔試劑處理，利用非干擾型蛋白質(zhì)濃度測定試劑盒測定蛋白質(zhì)濃度，80μg 分裝樣品，-80℃保存。

4蛋白質(zhì)的雙向電泳

第一向等點(diǎn)聚焦IEF按照IPGphorTM系統(tǒng)指南進(jìn)行。凝膠條選用pH 3-10，11 cm，上樣量銀染80μg，考染800μg，電泳參數(shù):30 v-12 hrs；500 v-1 hr；1000 v-1 hr；8000 v-8 hrs；500 v-4 hrs。第二向SDS-PAGE電泳，凝膠濃度12.5%，電泳參數(shù):15

mA/膠30 min；30 mA/膠至溴酚藍(lán)離膠下沿0.5 cm。考馬斯亮藍(lán)染色操作步驟參照蛋白質(zhì)快速染色試劑盒進(jìn)行。先用40%甲醇和10%冰乙酸的脫色液脫色三次，每次20 min，再用0.1%的冰乙酸脫色至背景干凈。

5凝膠掃描和圖像分析

掃描經(jīng)考馬斯亮藍(lán)染色的2-DE膠圖像，用ImageMasterTM 7.0 分析軟件對圖象進(jìn)行圖像加工、斑點(diǎn)檢測、膠圖匹配等分析，同時(shí)經(jīng)過蛋白質(zhì)點(diǎn)檢出和歸一化處理，對相同位置的蛋白質(zhì)點(diǎn)進(jìn)行定量分析，篩選低溫處理組和對照組淡色庫蚊雌成蚊蛋白質(zhì)雙向電泳圖譜上表達(dá)量相差2 倍以上的蛋白點(diǎn)作為差異蛋白點(diǎn)。

6蛋白質(zhì)的質(zhì)譜鑒定

挑選低溫處理組特有的14 個(gè)蛋白質(zhì)點(diǎn)做質(zhì)譜鑒定。切膠回收差異蛋白質(zhì)點(diǎn)，并對蛋白質(zhì)點(diǎn)進(jìn)行膠內(nèi)消化，銀染染色操作步驟參照Protein Stains K質(zhì)譜用快速銀染試劑盒。取1μL 酶解樣品直接點(diǎn)于樣品靶上，讓溶劑自然干燥，再取0.5μL 過飽和CHCA基質(zhì)溶液點(diǎn)至對應(yīng)靶位上自然干燥，樣品靶經(jīng)氮?dú)獯祪艉蠓湃雰x器進(jìn)靶槽進(jìn)行質(zhì)譜分析，數(shù)據(jù)處理由生工生物工程(上海)股份有限公司完成。

結(jié)果

1低溫處理前后淡色庫蚊SDS-AGE電泳

低溫處理組淡色庫蚊雌成蚊蛋白質(zhì)濃度為8.5 μg/μL，對照組淡色庫蚊蛋白質(zhì)濃度為4.76μg/μL，二者差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。淡色庫蚊雌成蚊低溫處理組和對照組SDS-PAGE電泳圖見圖1，從圖中可以看出，兩組蛋白的差異條帶較多，低溫處理組淡色庫蚊雌成蚊特有條帶主要集中在18.4～66.2 kDa 之間。

圖1淡色庫蚊SDS-PAGE電泳圖

2低溫處理前后淡色庫蚊雌成蚊雙向電泳

圖2低溫處理前后淡色庫蚊蛋白2-DE圖譜

低溫處理組和對照組淡色庫蚊蛋白質(zhì)雙向電泳平均得到蛋白質(zhì)點(diǎn)分別為2 807個(gè)和2 602 個(gè)(圖2)。 將所有的差異點(diǎn)都標(biāo)示在一張點(diǎn)最多的母膠上(圖3)，經(jīng)灰度比對，標(biāo)記差異點(diǎn)，共發(fā)現(xiàn)2 倍以上差異點(diǎn)77個(gè)，其中超過5倍的差異點(diǎn)11個(gè)；低溫處理組表達(dá)量上調(diào)的蛋白點(diǎn)30 個(gè)，表達(dá)量下調(diào)的蛋白點(diǎn)47個(gè)；低溫處理組特有的蛋白點(diǎn)14個(gè)，分子量主要在25～60 kDa 之間。

圖3低溫處理前后淡色庫蚊蛋白的雙向電泳圖譜

3質(zhì)譜分析結(jié)果

本實(shí)驗(yàn)選擇只在低溫處理組中有表達(dá)而對照組中無表達(dá)的14個(gè)蛋白質(zhì)點(diǎn)進(jìn)行質(zhì)譜分析(表1)，結(jié)果顯示與媒介蚊蟲相關(guān)的蛋白點(diǎn)有13個(gè)，其中成功鑒定肽段94條。經(jīng)Mascot 搜索，NCBI數(shù)據(jù)庫確認(rèn)，共鑒定出25個(gè)差異表達(dá)蛋白質(zhì)，主要為肌動(dòng)蛋白、醛糖還原酶、肌球蛋白重鏈、蘋果酸脫氫酶、精氨酸激酶、磷酸丙糖異構(gòu)酶、ATP 合酶D鏈、dj-1蛋白質(zhì)、酯酶B11、ATP 合酶-線粒體亞基、磷酸甘油酸變位酶、LIM domain-binding 蛋白質(zhì)、原肌球蛋白、果糖-二磷酸醛縮酶以及一些保守假設(shè)蛋白。這些蛋白多與細(xì)胞骨架的重塑、糖代謝、能量代謝和產(chǎn)生以及各種合成、代謝酶有關(guān)。

討論

本研究通過對低溫處理組和對照組蛋白質(zhì)含量的測定，結(jié)果發(fā)現(xiàn)低溫處理后淡色庫蚊體內(nèi)蛋白質(zhì)含量較對照組顯著增加，可見蛋白質(zhì)在淡色庫蚊躲避低溫迫害過程中發(fā)揮了重要作用，結(jié)合文獻(xiàn)資料[12，13]，進(jìn)一步證實(shí)蛋白質(zhì)可以增強(qiáng)淡色庫蚊的抗寒能力。利用雙向電泳技術(shù)，檢測到低溫處理組與對照組2 倍以上差異點(diǎn)77個(gè)，低溫處理組表達(dá)量上調(diào)的蛋白點(diǎn)30個(gè)，特有的蛋白點(diǎn)14個(gè)，說明低溫脅迫下，淡色庫蚊體內(nèi)蛋白質(zhì)表達(dá)水平發(fā)生了很大的變化，低溫可能誘導(dǎo)部分抗凍蛋白的產(chǎn)生和積累。經(jīng)質(zhì)譜鑒定分析，發(fā)現(xiàn)在低溫脅迫下，淡色庫蚊體內(nèi)發(fā)生變化的蛋白質(zhì)多與細(xì)胞骨架的重塑、糖代謝、能量代謝和產(chǎn)生，以及各種合成、代謝酶有關(guān)，該結(jié)果與淡色庫蚊越冬滯育蚊體內(nèi)蛋白質(zhì)的變化相一致[14]，進(jìn)一步證明低溫是誘導(dǎo)淡色庫蚊越冬滯育的重要條件之一。

表1低溫處理組淡色庫蚊特有蛋白的質(zhì)譜分析結(jié)果

該研究結(jié)果顯示低溫可誘導(dǎo)淡色庫蚊體內(nèi)蛋白質(zhì)含量和表達(dá)的變化，由于實(shí)驗(yàn)未設(shè)置多時(shí)間段低溫處理對比，可能造成一些與信號傳導(dǎo)相關(guān)的蛋白以及轉(zhuǎn)錄因子類的蛋白沒有被檢測到。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，越冬代淡色庫蚊體內(nèi)蛋白質(zhì)含量在越冬早期呈增加趨勢，越冬中后期含量下降，蛋白質(zhì)含量在不同的越冬時(shí)期會(huì)有不同程度的變化[15]。因此，下一步應(yīng)重點(diǎn)探索不同低溫處理時(shí)間淡色庫蚊體內(nèi)蛋白質(zhì)組成和含量的變化，尋找與抗寒性相關(guān)的蛋白質(zhì)即抗凍蛋白，為媒介蚊蟲越冬機(jī)制的研究提供更新支持。