胡麗, 趙亞娥?, 熊國典, 張又仁, 王昊若, 劉博

酒渣鼻是一種常見的慢性炎癥性皮膚病，患者主要表現(xiàn)為以鼻為中心的面部潮紅、毛細血管擴張、丘疹、膿皰等，嚴(yán)重?fù)p害患者容貌。 由于缺乏特效藥，使得該病經(jīng)久不愈、反復(fù)發(fā)作，患者長期承受精神和心理壓力，產(chǎn)生焦慮、抑郁等不良情緒[1]，甚至出現(xiàn)全身系統(tǒng)性疾病[2]，對生活質(zhì)量造成很大影響。 目前酒渣鼻的病因和發(fā)病機制尚不完全明確，已有的研究認(rèn)為遺傳、飲食、日曬、激素分泌、化妝品、蠕形螨等多種因素與酒渣鼻的發(fā)生有關(guān)[3]。 表皮作為人體抵御外界刺激的第一道屏障，90%以上為角質(zhì)形成細胞，通過表達多種模式識別受體，識別病原體相關(guān)分子模式(PAMPs)，發(fā)揮介導(dǎo)和調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)的功能[4]。 最新研究發(fā)現(xiàn)，酒渣鼻患者表皮角質(zhì)細胞Toll 樣受體2(TLR2)的表達量顯著高于面部健康人，并且繼發(fā)激肽釋放酶5(KLK5)表達增加，最終活化抗菌肽表達而出現(xiàn)酒渣鼻的臨床癥狀[5，6]。 因此，目前普遍認(rèn)為異常增高的TLR2 很可能是酒渣鼻發(fā)病的關(guān)鍵因素。

蠕形螨是引起蠕形螨樣酒渣鼻發(fā)生的重要危險因素，這在我們前期研究中已經(jīng)確認(rèn)[7-9]。 然而，蠕形螨引起酒渣鼻的致病機制并不完全清楚。 為了探究蠕形螨能否誘發(fā)角質(zhì)形成細胞表達TLR2，能否進一步活化TLR2 誘導(dǎo)相關(guān)炎性因子的釋放，本研究選擇毛囊蠕形螨為研究對象，使之與人永生化角質(zhì)形成細胞(HaCaT 細胞)建立共培養(yǎng)體系，通過蟲數(shù)梯度刺激實驗，觀察螨蟲數(shù)量與HaCaT 細胞表達TLR2 以及相關(guān)炎性因子之間的關(guān)聯(lián)性，揭示蠕形螨數(shù)量與TLR2 以及酒渣鼻發(fā)生之間的潛在關(guān)系。

材料與方法

1 材料

1.1 螨蟲收集與細胞獲取 采用透明膠帶粘貼法自陜西西安人面部皮膚收集毛囊蠕形螨成蟲[8]。HaCaT 細胞由西安交通大學(xué)第二附屬醫(yī)院皮膚病院贈予，保存于-196℃液氮罐中。

1.2 主要儀器與試劑 二氧化碳細胞培養(yǎng)箱(Memmer，德國)；超凈工作臺(泰斯特，中國)；倒置顯微鏡(Thermal Fisher，美國)；微量酶標(biāo)儀(Thermal Fisher，美國)；普通PCR 儀(ABI，Thermo scientific，美 國)； 實 時 定 量 PCR 儀( Agilent StrataGene Mx3005P，美國)；胎牛血清(BI，以色列)；青鏈霉素混合液(思科捷，中國)；DMEM 高糖培養(yǎng)基和0.25%胰酶(Gibco， Thermo scientific，美國)；RNA提取試劑盒(Qiagen，美國)；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和qRTPCR 試劑盒(艾科瑞，中國)。

2 方法

2.1 細胞復(fù)蘇與培養(yǎng) 將HaCaT 細胞株自液氮罐中取出，迅速放入37℃水浴鍋中水浴1～2 min；然后轉(zhuǎn)移至15 mL 離心管，加入9 mL 完全培養(yǎng)基(DMEM 高糖培養(yǎng)基+10%胎牛血清+1%谷氨酰胺替代物+1%青鏈霉素)，離心棄上清；最后，重新加入1 mL 完全培養(yǎng)基吹打混勻，按照1 ∶3 比例傳代。置于37℃含5% CO2及95%空氣飽和濕度的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。 細胞穩(wěn)定傳代后，倒置顯微鏡下觀察細胞狀態(tài)良好，即可用于實驗。

2.2 實驗分組與處理 采用臺盼藍染色計數(shù)法，取2×104活細胞均勻鋪至96 孔板中，置于細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；待細胞過夜貼壁后，用自制取螨針自透明膠帶分別挑取10 只、30 只和50 只活的毛囊蠕形螨成蟲于HaCaT 細胞完全培養(yǎng)液中，未加入螨蟲的HaCaT 細胞作為空白對照；在二氧化碳細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。 每組3 個重復(fù)。

2.3 細胞RNA 提取與反轉(zhuǎn)錄 螨蟲與HaCaT 細胞共培養(yǎng)24 h 后，棄去培養(yǎng)液，PBS 洗滌細胞兩次，倒置顯微鏡下確認(rèn)無螨蟲；然后加入細胞裂解液，采用刮取法將貼壁的HaCaT 細胞自培養(yǎng)板刮下，按照試劑盒說明書提取RNA，微量酶標(biāo)儀檢測RNA 濃度和質(zhì)量；最后，依據(jù)逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書將RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.4 引物設(shè)計與序列檢測 采用Primer premier 5.0 設(shè)計內(nèi)參基因β-肌動蛋白(ACTB)186 bp(模板NM_001101；上游:5’ -TGGCACCCAGCACAAT GAA- 3’，下 游:5’ - CTAAGTCATAGTCCGCCTA GAAGCA-3’)與待檢測目的基因TLR2、KLK5、白介素-1β(IL-1β)、IL-6、IL-8 和趨化因子配體2(CCL2)的qRT-PCR 引物(表1)。 采用常規(guī)PCR擴增各基因，純化回收PCR 產(chǎn)物進行克隆與測序，序列比對確認(rèn)一致性[10]。

2.5 qRT-PCR 檢測 反應(yīng)體系20 μL，包括2×SYBR Premix 10 μL，模板cDNA 1 μL，上、下游引物(10 μM)各0.4 μL，ROX(4 μM)0.4 μL，無菌水補足。 反應(yīng)程序采用試劑盒推薦的兩步法，即預(yù)變性95℃ 30 s，1 個循環(huán)；95℃ 15 s 變性，60℃ 30 s 退火、延伸，40 個循環(huán)；95℃ 1 min，55℃ 30 s，95℃ 30 s，1個循環(huán)，做熔解曲線。 為了保證結(jié)果的可信性，每個處理組3 個樣本，每個樣本3 個復(fù)孔。 最后，選擇2-△△CT法，根據(jù)CT 值計算各基因相對內(nèi)參基因的表達量。

2. 6 數(shù)據(jù)分析 采用 SPSS 18. 0 和GraphPad Prism 7.0 軟件進行數(shù)據(jù)分析，結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示。 采用單因素方差分析進行多組間差異分析，然后兩兩比較各組間差異，方差齊采用LSD-t檢驗。 采用Pearson相關(guān)性分析法分析表達量與蟲數(shù)之間的相關(guān)性，以相關(guān)系數(shù)(r)代表相關(guān)強度，絕對值越接近1 說明相關(guān)性越強。 以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1 螨蟲與HaCaT 細胞共培養(yǎng)體系建立

圖1A 為HaCaT 細胞經(jīng)1 ∶3 傳代培養(yǎng)兩天的貼壁狀態(tài)，可見細胞呈扁平狀、不規(guī)格多角形，界限清晰；胞漿均勻，細胞核呈圓形位于細胞中央；細胞之間緊密相連，細胞狀態(tài)良好，滿足共培養(yǎng)細胞的條件。 圖1B 為HaCaT 細胞與活的毛囊蠕形螨共培養(yǎng)24 h，螨蟲活動度好，顎體與足體活動自如，表明共培養(yǎng)體系構(gòu)建成功。

2 RNA 質(zhì)量評估與基因序列檢測

酶標(biāo)儀檢測顯示，RNA 濃度在30 ng/μL 左右，OD260/OD280在1.8 ～2.1 之間；特異性引物PCR 電泳顯示，ACTB、TLR2、KLK5、IL-1β、IL-6、IL-8 和CCL2 產(chǎn)物大小符合預(yù)期，條帶清晰，無引物二聚體，未出現(xiàn)非特異性擴增(圖2)；測序結(jié)果比對顯示，插入片段與相應(yīng)模板序列完全一致，無突變堿基(圖3)，表明本次提取的RNA 質(zhì)量和設(shè)計的特異性引物均滿足后續(xù)qRT-PCR 檢測的要求。

3 目的基因qRT-PCR 檢測

圖4 顯示，目的基因qRT-PCR 擴增曲線平整呈“S 型”，復(fù)孔重復(fù)性好，陰性對照無擴增， 表明加樣準(zhǔn)確且無污染；熔解曲線顯示各基因解鏈溫度在83～89℃之間，均為單峰，不存在引物二聚體或非特異性擴增，說明產(chǎn)物特異性好，定量結(jié)果準(zhǔn)確。qRT-PCR 結(jié)果顯示(圖5、圖6和表2)，雖然六個目的基因的相對mRNA表達量在10 只螨蟲組與空白組差異無統(tǒng)計學(xué)意義，但TLR2 和KLK5表達量與蟲數(shù)呈正相關(guān)，相關(guān)性有統(tǒng)計學(xué)意義(r=0.984 和0.974，P＜0.05)。30只螨蟲組TLR2 表達量明顯高于10 只螨蟲組和空白組(t=6.35和6.54，P＜0.001)；50只螨蟲組高于30只螨蟲組(t=4.31，P=0.003)。30只螨蟲組KLK5只高于空白組(t=3.31，P=0.011)，不高于10 只組；但50只螨蟲組高于10 只螨蟲組(t=2.79，P=0.024)。炎癥相關(guān)因子IL-6、IL-8和CCL2 表達量與蟲數(shù)也呈明顯正相關(guān)(r=0.970、0.984 和0.985，P＜0.05)，IL-1β相關(guān)性不顯著(r=0.938，P＞0.05)。在IL-6，表達量隨蟲數(shù)變化上調(diào)最明顯，50 只螨蟲組、30只螨蟲組和10只螨蟲組兩兩之間的差異均有統(tǒng)計學(xué)意義。在IL-8，50只螨蟲組和30 只螨蟲組均明顯高于10只螨蟲組和空白組，但50只組和30只組之間的差異無統(tǒng)計學(xué)意義(t=1.64，P=0.139)。在CCL2，50只螨蟲組與10只螨蟲組和空白組的差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=3.09，P=0.015；t=4.03，P=0.04)，30只螨蟲組與空白組差異也有統(tǒng)計學(xué)意義(t=3.12，P=0.014)，但其他各組兩兩比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義。在IL-1β，隨蟲數(shù)增加表達量變化更小，只有50 只螨蟲組與空白組差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=2.60，P=0.032)。

表1 目的基因引物信息

圖1共培養(yǎng)前的HaCaT 細胞形態(tài)(A)與共培養(yǎng)24 h后的螨蟲形態(tài)(B)

圖2 PCR 產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳圖

圖3基因序列比對

圖4 qRT-PCR 擴增曲線(A-C，G-I)和熔解曲線(D-F，J-L)

圖5共培養(yǎng)24 h后細胞TLR2與炎癥相關(guān)基因表達量比較

圖6目的基因表達量與螨蟲數(shù)量的線性相關(guān)分析

表2目的基因表達量與蟲數(shù)的相關(guān)性

討論

蠕形螨病是近年來才確認(rèn)的螨源性面部皮膚病，以毛囊糠疹、丘疹膿皰、結(jié)節(jié)肉芽腫等為典型皮膚損害，主要表現(xiàn)為酒渣鼻、痤瘡、毛囊炎、口周炎、脂溢性皮炎、瞼緣炎等[9]臨床癥狀。然而，由于蠕形螨寄生具有種的特異性，動物模型的構(gòu)建尚未見報道，郭霍法則無法直接驗證其致病性；螨蟲蟲體微小，蟲源獲取困難，DNA[11]、RNA[12]和蛋白[13]等分子水平的研究也長期面臨挑戰(zhàn)，這些直接限制了蠕形螨分子致病機制的研究。在此背景下，本研究首次選用HaCaT 細胞與毛囊蠕形螨共培養(yǎng)，旨在分子水平揭示蠕形螨對宿主角質(zhì)細胞免疫反應(yīng)的影響，具有以下三個亮點:一是改進細胞共培養(yǎng)模型，首次建立的毛囊蠕形螨與HaCaT 細胞共培養(yǎng)模型，替代了與皮脂腺細胞共培養(yǎng)模型，使得模型更接近毛囊蠕形螨在人體的微環(huán)境；二是采用蟲數(shù)梯度實驗，qRT-PCR 檢測細胞TLR2 和炎癥相關(guān)基因表達量變化，揭示蠕形螨蟲數(shù)與共培養(yǎng)細胞炎性因子間的數(shù)量效應(yīng)關(guān)系；三是實驗螨蟲均取自相同宿主，避免了來自不同宿主螨蟲可能存在的差異，使得結(jié)果更具說服力。因此，本研究的完成對于今后繼續(xù)深入研究蠕形螨與皮膚病發(fā)生的分子機制提供了新思路。

共培養(yǎng)起源于20世紀(jì)80 年代后期，最初是將人的兩種或兩種以上細胞共同培養(yǎng)于同一環(huán)境中，目的是為了最大程度模擬人體正常的生理或病理狀態(tài)，彌補無法直接在人體進行實驗研究的缺陷。之后逐漸拓展到微生物與細胞共培養(yǎng)，對于難以建立動物模型的病原體致病機制的研究提供了啟示。蠕形螨是寄生在人面部的常見病原體，目前不能動物培養(yǎng)，缺乏動物模型。然而，幸運的是，2018年Lacey 等人[14]首次嘗試將毛囊蠕形螨與皮脂腺細胞進行共培養(yǎng)，目的是探討蠕形螨在酒渣鼻中可能的致病作用。結(jié)果顯示，盡管TLR2、IL-1β和IL-6 等多種炎性因子在處理組與空白組的差異均無統(tǒng)計學(xué)意義，但IL-8和IL-10表達量在處理組與空白組的差異有統(tǒng)計學(xué)意義。這一研究設(shè)計引起了我們極大的興趣，我們認(rèn)為出現(xiàn)大部分陰性結(jié)果的原因可能是與毛囊蠕形螨共培養(yǎng)的細胞選擇皮脂腺細胞不當(dāng)有關(guān)。因為人毛囊蠕形螨主要寄生在毛囊漏斗部，而人皮脂蠕形螨主要寄生在皮脂腺內(nèi)。要建立與毛囊蠕形螨共培養(yǎng)的細胞模型，應(yīng)該選擇角質(zhì)形成細胞而非皮脂腺細胞。因此，本研究首次選用人永生化角質(zhì)形成細胞(HaCaT 細胞)替代了皮脂腺細胞，與毛囊蠕形螨共培養(yǎng)，培養(yǎng)環(huán)境應(yīng)該更接近毛囊蠕形螨在人體的寄生環(huán)境，從而得到了預(yù)期的實驗結(jié)果。

酒渣鼻的發(fā)生與TLR2和KLK5的異常表達和活化有關(guān)，本研究也得到了相似的實驗結(jié)果。 TLR2和KLK5表達量與蟲數(shù)呈明顯正相關(guān)，尤其是TLR2表達量隨蟲數(shù)上調(diào)更明顯，當(dāng)螨蟲數(shù)為30只時，表達量與空白組差異有統(tǒng)計學(xué)意義(2.84±0.34 vs 1.01±0.16)，50 只螨蟲時差異更明顯(4.05±0.57 vs 1.01±0.16)，這一結(jié)果與文獻報道的毛囊蠕形螨≥5只/毛囊(或/cm2皮膚)的蠕形螨病診斷標(biāo)準(zhǔn)相互印證[15]?？赡艿慕忉屖牵S著螨蟲數(shù)量的增加，毛囊蠕形螨的分泌物或者代謝產(chǎn)物作為TLR2的PAMPs，刺激共培養(yǎng)的HaCaT 細胞TLR2表達增加，炎癥反應(yīng)加強。這一結(jié)果可以部分解釋蠕形螨先天性缺乏免疫的酒渣鼻患者，蠕形螨大量繁殖引起嚴(yán)重的臨床癥狀，而在免疫功能正常的健康人，蠕形螨感染度低且鮮有臨床癥狀[16]。

TLR2表達增高會引起多種炎性因子表達增高[17]，本研究選擇前炎性因子IL-1β和IL-6以及趨化因子IL-8和CCL2進行了進一步檢測。IL-1β和IL-6均能夠刺激B細胞活化增殖分泌抗體，T 細胞增殖以及細胞毒性T 淋巴細胞(CTL)活化，發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)和介導(dǎo)炎癥作用；IL-8主要功能是吸引和激活中性粒細胞定向游走到反應(yīng)部位并釋放一系列活性物質(zhì)，導(dǎo)致機體局部炎癥反應(yīng)；CCL2則能夠趨化單核/巨噬細胞和T 淋巴細胞到炎癥部位，增強炎癥反應(yīng)。本次qRT-PCR 檢測發(fā)現(xiàn)，四種炎性因子的表達量也與蟲數(shù)呈正相關(guān)。在兩個前炎性因子，IL-6變化明顯強于IL-1β，50只螨蟲組與空白組的差異有統(tǒng)計學(xué)意義(2.27±0.13 vs 1.00±0.03；1.28±0.21 vs 1.00±0.09)，但30只螨蟲組只在IL-6 明顯上調(diào)(2.04±0.09 vs 1.25±0.07)。在兩個趨化因子IL-8和CCL2，IL-8變化強度強于CCL2，雖然兩者變化幅度沒有前炎性因子IL-6強，但是明顯強于IL-1β。這表明蠕形螨首先刺激TLR2 激活后，對這四種炎性因子的表達調(diào)控有所差異，從強到弱依次為IL-6、IL-8、CCL2 和IL-1β。

我們嘗試建立的毛囊蠕形螨與HaCaT 細胞共培養(yǎng)模型優(yōu)于毛囊蠕形螨與皮脂腺細胞共培養(yǎng)模型，TLR2 和IL-6 變化最明顯。本研究首次從細胞水平揭示皮膚免疫反應(yīng)與蠕形螨感染數(shù)量有關(guān)，當(dāng)感染的毛囊蠕形螨數(shù)量較多時，TLR2顯著上調(diào)，繼而激活相關(guān)信號通路，引起下游IL-6、IL-8、CCL2和IL-1β等炎性因子表達增加，參與皮膚損傷，導(dǎo)致蠕形螨病的發(fā)生。本研究作為毛囊蠕形螨與HaCaT 細胞第一次共培養(yǎng)的探索性實驗，雖然存在局限性，但對于揭示蠕形螨在酒渣鼻中的致病作用以及酒渣鼻分子發(fā)病機制的研究提供了新思路。