李汶霖,王鴻斌,李淑凝,王洋?,李志敏,沈海娥,劉紅寧,李幽美,趙旭安

1995年，Kohler S等通過酵母雙雜交技術篩選到一個與結腸腺瘤狀息肉蛋白(Aleriournatious polysis coli，APC)相互作用的蛋白質，由于該蛋白質是與APC的羧基端相互作用，因此被命名為末端結合蛋白1(End-binding protein 1，EB1)[1，2]。EB1在進化上非常保守，目前為止，在細菌、真菌、動物、植物中都鑒定出EB1的同源蛋白。EB1蛋白是一種重要的微管結合蛋白，其N端具有CH結構域，負責介導與微管的相互作用；C端是包含有EBH結構域的卷曲螺旋結構域，負責介導EB1的二聚化，并介導EB1與其他蛋白的相互作用；中間無定型結構的連接區(qū)將EB1的N端和C端連接起來。EB1對于微管的動態(tài)性調節(jié)具有重要的作用，并進而參與微管介導的多種細胞活動，如細胞極化、細胞運動、細胞有絲分裂等[3-6]。藍氏賈第鞭毛蟲(Giardialambia，簡稱賈第蟲)是一種世界性分布的條件致病性原生動物，能夠寄生于人和多種哺乳動物的小腸和膽囊引起以腹瀉、腹痛和吸收不良為主要表現的賈第蟲病[7]。賈第蟲被認為是最原始的真核生物之一，具有簡單的遺傳背景，非常適合用于保守基因的功能研究[8]。在前期實驗中[9，10]，我們通過酵母雙雜交發(fā)現賈第蟲EB1(gEB1)蛋白能與賈第蟲的特有骨架蛋白成分-α賈第素成員發(fā)生相互作用。為了更好的研究其相互作用機制，本研究擬從賈第蟲基因組中克隆geb1基因，并在大腸桿菌中進行表達，表達產物將為gEB1抗體的制備和功能研究提供材料[11]。

材料與方法

1材料

C2株賈第蟲、大腸桿菌菌株E.coliRosetta(DE3)、E.coliTOP10、原核表達質粒pET-28α(+)均由本實驗室保存；限制性內切酶NcoⅠ和XhoⅠ、Pyrobest DNA聚合酶購自大連寶生物公司；DNA片段凝膠回收試劑盒、質粒小量快速提取試劑盒、T4 DNA連接酶和DAB顯色試劑盒購自天根生化科技有限公司；兔源抗His單克隆抗體、HRP 標記的羊抗兔IgG 抗體購自北京康為世紀生物科技有限公司；引物合成及測序工作由上海生工生物技術有限公司完成。

2方法

2.1 C2 株賈第蟲滋養(yǎng)體的培養(yǎng)將液氮內凍存的C2 株賈第蟲復蘇，轉移到含改良TY-S-33培養(yǎng)基玻璃試管中，于37℃恒溫箱培養(yǎng)。3 d后待蟲體長滿管壁，用冰浴法傳代。將一支管壁長滿滋養(yǎng)體的試管冰浴10 min取出，在雙手掌間多次滾搓培養(yǎng)管，使貼壁生長的蟲體完全自管壁脫落，吸取蟲體培養(yǎng)液無菌條件下平均分裝成三管，37℃培養(yǎng)，2 ～3 d可長滿管壁。于倒置顯微鏡下觀察細胞生長狀況。選取傳代兩次、生長旺盛的對數期蟲體，離心收集蟲體團塊。

2.2 PCR 擴增geb1基因片段使用DNA Kit試劑盒，按說明書提取C2型藍氏賈第蟲全基因組DNA。

根據GenBank上WB型賈第蟲eb1基因(XM_

001706021.1)序列設計1對引物，P1(上游引物):5’-CATGCCATGG GCATGGCGCCGGTAAAAGCAC-3’和P2(下游引物):5’-CCGCTCGAGCTGATGATACTCCGCATACAGAATATC-3’，上下游引物分別含有NcoⅠ和XhoⅠ酶切位點(下劃線部分)。以賈第蟲DNA為模板，P1、P2為引物，PCR 擴增目的序列，反應條件為:94℃預變性5 min；94℃30 s，55℃30 s，72℃90 s，共30個循環(huán)；72℃延伸10 min。PCR 產物經1.0%瓊脂糖凝膠電泳，DNA膠回收試劑盒回收目的片段，回收產物經瓊脂糖凝膠電泳估濃度。

2.3 gEB1原核表達重組載體的構建膠回收產物和pET-28α(+)載體分別經NcoⅠ和XhoⅠ雙酶切，37℃4 h，酶切產物膠回收后瓊脂糖電泳估濃度。酶切回收后的目的基因和pET-28α(+)載體按摩爾比4∶1混合，16℃連接反應4 h。連接產物轉化E.coliDH5α感受態(tài)細胞，通過卡那霉素抗性平板篩選陽性克隆，挑取陽性單克隆菌落搖菌提質粒后雙酶切鑒定。

2.4 gEB1賈第素重組蛋白的誘導表達和鑒定將鑒定正確的質粒轉化E.coliRosetta(DE3)，涂卡那霉素和氯霉素雙抗平板，挑取陽性單菌落于含雙抗的液體LB培養(yǎng)基中37℃震蕩培養(yǎng)過夜按1%的接種量轉接于3 mL 新鮮雙抗LB培養(yǎng)基中，剩余菌液提取質粒并送檢測序，測序正確者進行誘導表達，確保構建的質粒無堿基突變。當OD600達到0.4 ～0.6時加入0.1 mM終濃度的異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)于30℃誘導表達5 h。收集菌液離心，用200μL 無菌水和等體積2×SDS上樣緩沖液重懸，煮沸5 min后離心，取20μL 上清行SDS-PAGE。電泳后一部分條帶用考馬斯亮藍染色觀察，一部分經濕轉法l50 mA 1.5 h電轉移至NC膜用于Western blot 鑒定。轉完后的NC膜脫脂奶室溫封閉2 h，以抗His-Tag 兔源多克隆抗體(1∶1 000)為一抗，4℃孵育過夜，TBST 洗滌3次，加入HRP 標記的羊抗兔IgG(1∶5 000)室溫反應l h，TBST 洗滌后經DAB顯色，觀察結果。

結果

1 geb1基因的PCR 擴增結果

提取C2株賈第蟲全基因組DNA進行濃度的測定。微量核酸測定儀檢測可見一單峰，OD260/OD280為1.822 8，說明樣本純度較高，濃度為414.266 1 ng/μL。以賈第蟲基因組DNA 為模版克隆geb1基因編碼區(qū)，PCR擴增產物經1.5%瓊脂糖凝膠電泳分析，可見760 bp的特異性條帶，與預期大小相符(圖1)。

圖1 geb1基因PCR 產物的瓊脂糖凝膠電泳分析

2重組質粒的酶切鑒定

目的基因經雙酶切后與pET-28α(+)相連，連接產物轉化E.ColiTOP10，陽性克隆提取質粒后經NcoI和XhoI雙酶切鑒定，電泳分別可見約760 bp的geb1基因目的片段、約5 300 bp的載體pET-28α(+)兩條電泳條帶(圖2)，與預期結果一致，將進一步測序驗證正確的質粒命名為pET-28α(+)-gEB1。

圖2 pET-28α(+)-gEB1表達載體的雙酶切鑒定

3 geb1基因的誘導表達和鑒定

重組質粒pET-28α(+)-gEB1轉化E. coliRosetta(DE3)，0.1 mM IPTG 誘導表達5 h，并將所得產物煮沸裂解進行SDS-PAGE實驗，以未誘導的重組質粒轉化菌作為對照，SDS-PAGE驗證重組蛋白的表達結果(圖3)。結果顯示誘導菌在分子量29 kDa 處有出現一條明顯的條帶，而未誘導菌沒有此條帶，與預期相符合(圖4)。Western blot 確認此條帶確為gEB1-His Tag 融合蛋白。

圖3 SDS-PAGE電泳鑒定IPTG 誘導融合蛋白表達情況

圖4 geb1基因融合蛋白Western blot 分析

討論

EB1蛋白是一種微管正極示蹤蛋白(plus-end tracking proteins，+TIPs)，能夠結合在微管正在生成的正末端，促進微管持續(xù)性生長。EB1蛋白家族與其它+TIPs的主要區(qū)別在于EB1能夠自發(fā)的追蹤生長微管的正末端而不依賴于任何其它蛋白質和分子，并且EB1可以通過與+TIPs的相互作用，發(fā)揮平臺作用，將其它+TIPs募集到微管的正末端使其發(fā)揮各自的功能[12-14]。因此EB1蛋白在形成微管正末端復合物中具有核心作用，影響微管動態(tài)性。

賈第蟲具有高度發(fā)達的細胞骨架系統(tǒng)，由微管、微絲和細胞骨架蛋白所構成，近年來的研究證實，賈第蟲的細胞骨架蛋白與其感染和致病有著密切關系[15]。賈第素是一類特異性細胞骨架蛋白[16，17]，目前已將其分成α-賈第素、β-賈第素、γ-賈第素和δ-賈第素4 大家族，每一個成員的具體功能目前未知[18-20]。以往的研究顯示，gEB1能夠與γ-賈第素直接發(fā)生相互作用。我們通過酵母雙雜交實驗發(fā)現，gEB1與α-賈第素家族的成員也存在相互作用。通過鑒定gEB1蛋白與賈第素蛋白相互作用的機制和生物學意義去反推兩種賈第素的具體功能或許是個有效的方法，為此我們克隆了geb1基因并進行了原核表達。

由于賈第蟲沒有內含子的原始特性，我們直接從賈第蟲的基因組上克隆了gEB1的編碼區(qū)，測序結果顯示C2株賈第蟲eb1基因序列與WB株相同，編碼的gEB1蛋白由238個氨基酸殘基組成，分子量大約是29kDa，略小于人類的EB1蛋白，具有明確分區(qū)的CH結構域和EBH結構域[21]。但gEB1蛋白序列與高等動物的同源蛋白的一級結構上存在較大的差異，因此市售的小鼠或者人類EB1蛋白抗體均不能和gEB1結合。為了進一步證明gEB1與α-賈第素成員的相互作用，制備gEB1特異性抗體成為當務之急，gEB1的原核表達為其抗體的制備提供了基礎，賈第蟲也可作為EB1蛋白功能研究的良好模式生物。