唐 帆，黃永周，龐麗娟，侯吉學(xué)

細胞衰老是指在多種內(nèi)外因素刺激下，細胞內(nèi)一系列信號通路被激活導(dǎo)致不可逆的細胞周期停滯，其特征主要有染色質(zhì)改變、細胞代謝及形態(tài)的改變以及β-半乳糖苷酶的活性增強[1-2]。p53/p21信號通路是調(diào)節(jié)細胞衰老的主要機制之一，多種誘導(dǎo)細胞衰老的刺激因子主要通過激活該通路而發(fā)揮功能[3]。誘導(dǎo)腫瘤細胞衰老可抑制腫瘤細胞的增殖，激活機體免疫反應(yīng)，促進衰老的腫瘤細胞及周圍正常的腫瘤細胞被清除[4-5]。二磷酸鳥苷(guanosine diphosphate, GTP) 激活蛋白SH3結(jié)構(gòu)域結(jié)合蛋白2(RasGAP binding protein 2，G3BP2)是G3BPs家族中的一員，是大鼠肉瘤病毒(rat sarcoma, Ras) 信號通路的關(guān)鍵調(diào)控因子[6]，參與多種細胞內(nèi)信號傳遞。另外G3BP2是應(yīng)激顆粒的重要組成因子，保護其中的RNA不被細胞中的RNA酶所降解[7]，是目前腫瘤領(lǐng)域研究中的重要目標。該研究以結(jié)腸癌腫瘤細胞為主要研究對象，初步探討G3BP2對結(jié)腸癌細胞衰老的調(diào)控及作用機制，為腫瘤治療提供新思路。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑結(jié)腸癌細胞LoVo來自于石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院病理科實驗室。Lipofectamine 2000購于美國Thermo Scientific公司；胎牛血清(FBS)購于美國Gibco公司；高糖DMEM培養(yǎng)基購于美國HyClone公司；CCK8試劑購于美國MedChemExpress公司；細胞衰老β-半乳糖苷酶染色試劑盒購于上海碧云天生物技術(shù)有限公司；G3BP2抗體購于美國Abcam公司；p53和p21抗體購于美國CST公司；針對G3BP2的siRNA及對照購于廣州銳博生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1細胞培養(yǎng) 取出凍存于液氮中的LoVo細胞，將其放入37 ℃水浴鍋中快速解凍，經(jīng)1 200 r/min離心后，棄上清液，加入新鮮DMEM高糖培養(yǎng)基(含10% FBS)重懸細胞，將其移至培養(yǎng)瓶中，置于含5% CO2的37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2.2真核細胞的轉(zhuǎn)染 將結(jié)腸癌細胞種于6孔板中培養(yǎng)過夜；移去上清培養(yǎng)基，換上新鮮無血清DMEM高糖培養(yǎng)基；分別將siRNA及Lipofectamine 2000加入小體積無血清培養(yǎng)基中；將以上轉(zhuǎn)染液輕柔混勻后加入6孔板中；4～6 h后移去轉(zhuǎn)染試劑，加入新鮮完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)48～72 h。

1.2.3CCK8細胞增殖檢測 將結(jié)腸癌細胞種于96孔板中培養(yǎng)過夜；分別予以不同的轉(zhuǎn)染處理，4～6 h后將轉(zhuǎn)染液換為正常完全培養(yǎng)基；將CCK8稀釋成工作濃度，將工作液加入96孔板對應(yīng)孔中，繼續(xù)放于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；2～4 h后用酶標儀檢測光密度(optical density，OD)490 nm，計算細胞活力。

1.2.4細胞衰老β-半乳糖苷酶染色 將結(jié)腸癌細胞種于6孔板中，進行不同轉(zhuǎn)染處理；棄去上清液培養(yǎng)基，加入細胞固定液處理15 min；棄去固定液，經(jīng)PBS搖洗3次后加入衰老細胞染色液(A液10 μl；B液10 μl；C液930 μl；X-Gal溶液50 μl)；在37 ℃不含CO2條件下孵育過夜，PBS洗2～3次；顯微鏡下拍照，統(tǒng)計分析。

1.2.5Western blot法 棄去細胞上清液培養(yǎng)基，PBS洗3次；加入RIPA裂解液，放于冰上裂解30 min；在4 ℃條件下，12 000 r/min離心10 min，取上清液；BCA法測蛋白濃度；蛋白上清液加入5×蛋白上樣緩沖液，100 ℃煮5 min；蛋白樣品經(jīng)上樣、電泳，轉(zhuǎn)至PVDF膜上；5% BSA封閉1 h，4 ℃條件下孵育一抗(G3BP2濃度1 ∶1 000，p53濃度1 ∶1 000，p21濃度1 ∶1 000，GAPDH濃度1 ∶2 000)；室溫孵育二抗(G3BP2、p53、p21羊抗兔1 ∶5 000，GAPDH羊抗鼠1 ∶5 000)后，TBST洗2～3次；采用化學(xué)發(fā)光法檢測蛋白表達情況。

1.2.6實時定量PCR 消化離心各組細胞，PBS洗3次；通過TRIzol法提取細胞mRNA；通過兩步法將mRNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA；將cDNA、引物和TB Green Fast qPCR Mix混合配制成PCR反應(yīng)液；上機檢測后處理數(shù)據(jù)。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理所有實驗均重復(fù)3次，采用SPSS 23.0軟件對實驗數(shù)據(jù)進行分析，所得結(jié)果以mean±SD表示。兩組間的數(shù)據(jù)比較采用t檢驗，多組間的數(shù)據(jù)比較采用方差分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 G3BP2對結(jié)腸癌細胞增殖的影響利用真核細胞轉(zhuǎn)染技術(shù)分別將siNC、siG3BP2#1和siG3BP2#2轉(zhuǎn)入LoVo中，72 h后提取蛋白，經(jīng)Western blot檢測各組細胞中G3BP2的表達水平。如圖1所示， siG3BP2#1和siG3BP2#2組細胞中G3BP2的蛋白水平明顯比siNC組更低，提示G3BP2低表達細胞模型構(gòu)建成功(圖1A)。同樣將G3BP2過表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)入結(jié)腸癌細胞LoVo中，成功構(gòu)建G3BP2過表達細胞模型(圖1C)。接著將不同組細胞(siNC、siG3BP2#1和siG3BP2#2)種于96孔板中，分別在0、24、48和72 h利用CCK8法檢測各組細胞增殖情況，繪制生長曲線，結(jié)果顯示，與siNC組相比，siG3BP2#1和siG3BP2#2組細胞的生長曲線相對平緩，其細胞生長速度更加緩慢，提示低表達G3BP2可抑制結(jié)腸癌細胞的增殖能力(F=14.466,P=0.005)，見圖1B。同樣利用CCK8檢測vector及G3BP2過表達組細胞的增殖情況，結(jié)果顯示與Vector組相比，過表達G3BP2組細胞生長更快，提示過表達G3BP2可提高結(jié)腸癌的增殖能力(F=0.87,P=0.007)，見圖1D。

2.2 G3BP2對結(jié)腸癌細胞衰老的影響構(gòu)建G3BP2低表達(siG3BP2#1和siG3BP2#2)LoVo細胞系，因為在正常情況下腫瘤細胞發(fā)生衰老的比例較低，因此同時加入多柔比星誘導(dǎo)結(jié)腸癌細胞的衰老。多柔比星誘導(dǎo)48 h后，再利用β-半乳糖苷酶染色法對細胞進行染色，顯微鏡下觀察各組細胞中染色情況，并對結(jié)果進行統(tǒng)計分析，結(jié)果顯示：與對照組siNC的染色細胞比例(32±5.10)%相比，siG3BP2#1組比例增加至(57.33±3.68)%(F=0.598,P=0.005)；siG3BP2#2組比例為(56±6.68)%(F=0.276,P=0.016)。說明該組中發(fā)生衰老的結(jié)腸癌細胞更多(圖2A)。這提示低表達G3BP2可誘導(dǎo)結(jié)腸癌細胞發(fā)生衰老。同樣的，對過表達G3BP2及Vector組細胞進行衰老染色，結(jié)果顯示：過表達G3BP2后，衰老的細胞比例從(35.33±2.87)%降低至(25±2.94)%(F=0.026,P=0.024)，這提示過表達G3BP2可抑制結(jié)腸癌細胞衰老(圖2B)。

2.3 G3BP2可對p53/p21通路進行調(diào)控為明確G3BP2對結(jié)腸癌細胞調(diào)節(jié)的具體機制，筆者提取了siNC、siG3BP2#1和siG3BP2#2組細胞的蛋白，利用Western blot技術(shù)檢測各組細胞中蛋白表達的變化，結(jié)果顯示，與對照組相比，低表達G3BP2組細胞中p53及p21的蛋白水平明顯增高，這提示低表達G3BP2可激活p53/p21信號通路(圖3A)。同樣用Western blot檢測vector及過表達G3BP2組細胞中的蛋白變化，與上述結(jié)果相反，過表達G3BP2可抑制p53及p21的蛋白表達，抑制p53/p21信號通路(圖3B)。p53蛋白在細胞內(nèi)往往受轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)節(jié)，為進一步明確G3BP2對p53調(diào)節(jié)機制，提取各組細胞的mRNA，通過RT-PCR檢測其中p53的表達，結(jié)果顯示，與對照組相比，低表達及過表達G3BP2組細胞中p53 mRNA水平均無明顯變化，這提示G3BP2可能通過調(diào)節(jié)p53的蛋白穩(wěn)定性抑制p53/p21信號通路(圖3C、D)。

圖1 G3BP2對結(jié)腸癌細胞增殖的影響A：Western blot檢測G3BP2基因在結(jié)腸癌細胞的敲減效率；B：CCK8法顯示低表達G3BP2可抑制結(jié)腸癌細胞的增殖能力；與siNC比較：**P<0.01；C：Western blot檢測G3BP2的過表達效率；D：CCK8法檢測過表達G3BP2可促進結(jié)腸癌細胞的增殖能力；與Vector比較：##P<0.01

圖2 G3BP2對結(jié)腸癌細胞衰老的影響β-半乳糖苷酶染色法×400A：低表達G3BP2可促進結(jié)腸癌細胞衰老；與siNC比較：*P<0.05,**P<0.01；B：過表達G3BP2可抑制結(jié)腸癌細胞衰老；與Vector比較：#P<0.05

2.4 G3BP2對結(jié)腸癌細胞增殖的調(diào)節(jié)依賴于p53為確認G3BP2通過p53信號通路發(fā)揮促進腫瘤生長的功能，將siG3BP2和sip53共同轉(zhuǎn)入結(jié)腸癌細胞中，利用CCK8法檢測siNC、siG3BP2及siG3BP2+sip53組細胞生長情況，如圖4所示，siG3BP2組細胞如預(yù)期可抑制結(jié)腸癌細胞的生長，而在同時轉(zhuǎn)入sip53后，低表達G3BP2引起的細胞增殖抑制作用被逆轉(zhuǎn)(F=10.193,P=0.012)，見圖4A；同樣的，在過表達G3BP2細胞中轉(zhuǎn)入p53過表達質(zhì)粒，利用CCK8法檢測各組細胞在不同時間點的細胞活力，結(jié)果顯示過表達G3BP2可促進結(jié)腸癌細胞的增殖，而過表達p53可逆轉(zhuǎn)其促進細胞增殖的作用(F=6.586,P=0.031)，見圖4B。上述結(jié)果提示，G3BP2對結(jié)腸癌細胞增殖的調(diào)節(jié)主要依賴p53通路。

2.5 G3BP2通過p53抑制結(jié)腸癌細胞衰老利用β-半乳糖苷酶染色法檢測siNC、siG3BP2及siG3BP2+sip53組細胞衰老水平，如圖5所示，與對照組相比，低表達G3BP2后結(jié)腸癌細胞衰老比例從(36.00±4.08)%升高至(58.67±4.50)%(F=0.034,P=0.006)，而同時低表達p53后，衰老細胞的比例則降低至(47.00±3.74)%(F=0.034,P=0.006)；同樣對Vector、G3BP2和G3BP2+p53組細胞進行衰老染色，結(jié)果顯示結(jié)腸癌細胞在過表達G3BP2后，衰老細胞比例從(38.33±2.62)%降低至(25.67±3.40)%(F=0.319,P=0.014)；而同時過表達G3BP2和p53后，衰老細胞的比例則再次升高至(35.00±1.63)%(F=2.286,P=0.025)。以上結(jié)果提示，G3BP2通過p53蛋白實現(xiàn)對結(jié)腸癌細胞衰老的調(diào)控。

3 討論

細胞衰老是多種細胞刺激，比如氧化應(yīng)激、DNA損傷以及某些癌基因的激活等，誘導(dǎo)細胞處于一種不可逆轉(zhuǎn)的細胞周期停止狀態(tài)[8]。最近文獻[9]報道，誘導(dǎo)細胞衰老是抑制癌癥發(fā)生發(fā)展的有效初始屏障。越來越多的數(shù)據(jù)表明某些治療性化合物可以誘導(dǎo)衰老，與誘導(dǎo)癌細胞死亡相比，它在抑制腫瘤進展的同時，避免了由正常組織損傷引起的嚴重副作用。因此誘導(dǎo)腫瘤細胞的衰老是腫瘤治療中一個很有前景的治療策略。

圖3 G3BP2可對p53/p21通路進行調(diào)控A：Western blot檢測低表達G3BP2對p53和p21的蛋白水平影響；B：Western blot檢測過表達G3BP2對p53和p21蛋白水平的影響；C：RT-PCR檢測低表達G3BP2對p53 mRNA水平的影響；D：RT-PCR檢測過表達G3BP2對p53 mRNA水平的影響

圖4 G3BP2對結(jié)腸癌細胞增殖的調(diào)節(jié)依賴于p53A：CCK8法檢測siNC、siG3BP2#1和siG3BP2+sip53組細胞增殖能力變化；與siG3BP2#1比較：*P<0.05；B：CCK8法檢測Vector、G3BP2和G3BP2+p53組細胞增殖能力變化；與過表達G3BP2比較：#P<0.05

圖5 G3BP2通過p53抑制結(jié)腸癌細胞衰老 β-半乳糖苷酶染色法×400A、B： β半乳糖苷酶染色法檢測siNC、siG3BP2#1和siG3BP2#1+sip53組衰老細胞的變化；與siNC比較：**P<0.01；與siG3BP2#1比較：#P<0.05；C、D：β半乳糖苷酶染色法檢測Vector、G3BP2和G3BP2+p53組衰老細胞的變化；與Vector比較：△P<0.05；與過表達G3BP2比較：▲P<0.05

G3BP2是調(diào)節(jié)Ras信號通路的關(guān)鍵因子，通過結(jié)合在RasGAP蛋白的SH3結(jié)構(gòu)域，激活Ras通路[6]。Ras蛋白的主要下游信號軸有兩條：Raf/Erk和PI3K/Akt信號通路。Ras主要通過激活以上兩條通路，參與細胞增殖及存活的過程。除此之外，G3BP2在心肌肥厚發(fā)生過程中也起著重要作用，它可與IκBα蛋白結(jié)合，促進核因子κB(nuclear factor kappa-B，NF-κB)組成成分之一p65的核轉(zhuǎn)運，從而激活NF-κB信號[10]。在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中G3BP2也扮演著關(guān)鍵角色。有文獻[6-7]報道，G3BP2在多種人類惡性腫瘤中，比如乳腺癌、前列腺癌、頭頸部腫瘤以及肺癌，存在過表達情況，進一步的研究表明，G3BP2參與多種腫瘤發(fā)生發(fā)展相關(guān)的信號通路?；谄湓诙喾N生物過程和疾病發(fā)病機制(包括腫瘤發(fā)生)中的重要參與，G3BP2已成為許多腫瘤學(xué)研究中分子研究的目標。本研究顯示低表達G3BP2可抑制結(jié)腸癌細胞的增殖，而過表達G3BP2則促進結(jié)腸癌細胞的生長。進一步研究表明，G3BP2主要通過調(diào)控結(jié)腸癌細胞的衰老，進而調(diào)控其增殖。

p53/p21和p16/Rb通路是調(diào)控細胞衰老網(wǎng)絡(luò)中的關(guān)鍵信號節(jié)點，這兩條通路的激活是細胞衰老發(fā)生的標志[11]。p53是一種重要的抑癌基因，它結(jié)合并激活下游靶基因的啟動子，促進基因的轉(zhuǎn)錄，參與腫瘤的增殖、凋亡及DNA損傷等重要過程，其對細胞衰老的調(diào)控主要通過其靶基因p21來完成的[12]。p21是Cip/Kip 家族中的一員，通過抑制CDK家族蛋白的活性，導(dǎo)致細胞周期發(fā)生阻滯，直接參與細胞衰老的激活過程[13]。國內(nèi)外學(xué)者已有報道[14-15]，多種途徑可對p53進行調(diào)節(jié)，進而調(diào)控腫瘤細胞衰老，具有潛在的臨床應(yīng)用前景。

本實驗顯示低表達G3BP2可以促進p53及p21的蛋白表達，過表達G3BP2則抑制p53及p21的蛋白表達，通過阻遏實驗則驗證G3BP2對結(jié)腸癌細胞的衰老及增殖的影響主要是依賴于p53通路。進一步的研究表明G3BP2對p53 mRNA水平無明顯調(diào)節(jié)作用，這提示G3BP2可能通過轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)節(jié)p53信號通路。G3BP2可激活Ras蛋白，進而激活PI3K/AKT通路。因此筆者推測，G3BP2對p53的調(diào)節(jié)可能是通過PI3K/AKT通路，尚需要后續(xù)實驗對其具體機制進行探索。本實驗明確了G3BP2對結(jié)腸癌細胞衰老調(diào)控的作用及可能機制，為以誘導(dǎo)腫瘤細胞衰老為目的的腫瘤治療策略提供了可能的靶點及線索。