余 坤，李鴻生，張琳玲，杜亞茜，李 權(quán)，王曉雄，蔡靜靜，馬露瑤，周永春

肺癌作為當(dāng)下“頭號殺手”，是全球病死率最高、發(fā)展最快的肺原發(fā)性惡性腫瘤。2019年初，新的癌癥統(tǒng)計(jì)名單公布，肺癌依舊獨(dú)占鰲頭[1-2]，其中，女性肺癌例數(shù)呈逐年遞增態(tài)勢，防控形勢嚴(yán)峻[3]。有研究[4]顯示，帶有轉(zhuǎn)移灶的晚期肺癌患者，經(jīng)治療后的5年生存率不足10%，臨床腫瘤患者90%以上死于腫瘤轉(zhuǎn)移。轉(zhuǎn)移是造成肺癌難以根治的最根本原因。國內(nèi)外眾多研究發(fā)現(xiàn)多種因子發(fā)揮轉(zhuǎn)錄與非轉(zhuǎn)錄作用參與腫瘤的生物學(xué)行為，其中，性別決定基因-相關(guān)蛋白結(jié)構(gòu)域4[sex determining region Y-related(SRY)-type high mobility group (HMG)-box4,SOX4]基因位于Y染色體的6p22.3[5]可通過活化Wnt、TGF-β、Hedgehog及Notch等通路或經(jīng)miRNA的調(diào)節(jié)，參與多癌種的增殖、遷移與侵襲。但到目前為止，對SOX4在肺癌發(fā)生發(fā)展中的作用機(jī)制尚未明確。因此，該研究通過細(xì)胞培養(yǎng)及分子實(shí)驗(yàn)探討SOX4與上皮細(xì)胞-間充質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化(epithelial to mesenchymal transition, EMT)間的相互關(guān)系及其機(jī)制，為精準(zhǔn)醫(yī)療、臨床監(jiān)測、預(yù)后評估及科研工作提供理論指導(dǎo)，同時(shí)，為各類型肺癌的個(gè)體化診療提供新的生物學(xué)標(biāo)志物和潛在的干預(yù)靶點(diǎn)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞株人正常上皮細(xì)胞(BEAS-2B)；肺腺癌細(xì)胞(95D、A549、H1299、H23、H292、HCC827、SPCA-1、XWLC-05)；肺鱗癌細(xì)胞(H226、SK-MES-1)、大細(xì)胞肺癌細(xì)胞(H460)由教育部高原區(qū)域性高發(fā)腫瘤國際合作聯(lián)合實(shí)驗(yàn)室、云南省肺癌研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供；正常支氣管上皮細(xì)胞16HBE、小細(xì)胞肺癌細(xì)胞H446、肺腺癌細(xì)胞H157由中國科學(xué)院昆明動(dòng)物研究所陳勇斌課題組饋贈(zèng)。

1.2 主要試劑質(zhì)粒由上海吉瑪公司構(gòu)建；DMEM、RPMI 1640、FBS、Opti-MEM、0.25% Trypsin-EDTA (1X)購自美國Gibco公司；Lipofectamine 2000、TRIzol試劑購自美國Invitrogen公司；cOmpleteTMProtease Inhibitor Cocktail、PCR反應(yīng)試劑盒購自美國Roche公司；BD Matrigel Basement Membrane Matrix購自美國B.D公司；6.5 mm Transwell? with 8.0 μm Pore Polycarbonate購自美國Corning公司；RABBIT anti-SOX4 polyclonal antibody購自美國Millipore公司；Anti-SNAIL antibody(Goat)、Anti-Vimentin antibody (Mouse)、Anti-N-Cadherin antibody (Rabbit)和Anti-E-Cadherin antibody (Mouse)購自美國Abcam公司；Anti-Mouse IgG(HRP-Linked)Antibody和Anti-rabbit IgG, HRP-linked Antibody購自美國CST公司；Rabbit Anti-Goat IgG(H+L)HRP購自美國Affinity公司。

1.3 主要儀器二氧化碳培養(yǎng)箱(型號：3311)、生物安全柜(型號：HYCD-282)購于美國Thermo Scientific公司；熒光定量PCR儀(型號：7500)購于美國Life Technologies公司；倒置熒光顯微鏡(型號：DMI4000B)購于德國LEICA公司；核酸蛋白定量儀(型號：NanoDrop2000)、酶標(biāo)儀(型號：1510)購于美國Thermo公司。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1細(xì)胞培養(yǎng) BEAS-2B、SK-MES-1培養(yǎng)于DMEM高糖培養(yǎng)基(含10% FBS、1% PS)，余細(xì)胞培養(yǎng)于1640完全培養(yǎng)基(含10% FBS、1% PS)，放置37 ℃、5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中，細(xì)胞貼壁生長至80%左右，用血球計(jì)數(shù)板與細(xì)胞計(jì)數(shù)儀MoxiZ_Firmware計(jì)數(shù)，以每孔1.2×105個(gè)細(xì)胞進(jìn)行6孔板鋪板。參照Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑盒中提供的操作說明進(jìn)行轉(zhuǎn)染。設(shè)置Blank為空白對照組、GFP為質(zhì)粒對照組、NC為shRNA對照組；pEX-2-SOX4為過表達(dá)實(shí)驗(yàn)組，siRNA803為沉默實(shí)驗(yàn)組。

1.4.2實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(quantitative real time polymerase chain reaction, qRT-PCR)檢測目的基因表達(dá)情況 按TRIzol法提取RNA試劑盒說明書，提取各組對數(shù)生長期的細(xì)胞RNA。按照RNA反轉(zhuǎn)錄合成試劑盒將RNA 反轉(zhuǎn)錄為cDNA。本研究所用PCR引物由云南擎碩科技有限公司合成，引物序列見表1。以cDNA為模板，RPS18為內(nèi)參，采用兩步法行PCR檢測：第1步預(yù)變性95 ℃、5 min；第2步變性95 ℃、5 s，退火延伸60 ℃、30 s；40個(gè)循環(huán)。以2-ΔΔCt表示mRNA相對表達(dá)水平。

表1 實(shí)時(shí)定量PCR目的基因的引物

1.4.3蛋白質(zhì)免疫印跡(Western blot, WB)檢測 成功轉(zhuǎn)染目的質(zhì)粒48 h后，在冰上用配好的裂解液進(jìn)行總蛋白提取。BCA法進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制及蛋白濃度測定，以40 μg對應(yīng)體積上樣，經(jīng)SDS-PAGE凝膠電泳后，將蛋白分子濕轉(zhuǎn)到PVDF膜，用5%脫脂牛奶封閉120 min后加入一抗(SOX4稀釋比例為1 ∶500；β-actin稀釋比例為1 ∶1 000；E-鈣黏附素(E-Cadherin,E-Cad)稀釋比例為1 ∶500；N-鈣黏蛋白(N-cadherin, N-Cad)稀釋比例為1 ∶500；波形蛋白(vimentin, Vim)稀釋比例為1 ∶500；Snail稀釋比例為1 ∶500)。4 ℃搖床12 h，用TBST在搖床上漂洗3次，每次15 min后加入二抗(稀釋比例均為1 ∶2 000)搖床12 h，用TBST在搖床上漂洗3次，每次15 min，用ECL通過GeneSys曝光成像，用Image J對目標(biāo)條帶進(jìn)行灰度值分析。

1.4.4CCK8測定細(xì)胞增殖及細(xì)胞活性 轉(zhuǎn)染目的質(zhì)粒24 h后，收集細(xì)胞，計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞懸液濃度至5×103/ml，接種細(xì)胞于96孔板，200 μl/孔，每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。完成后將孔板置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)相應(yīng)時(shí)長。吸棄待測孔的培養(yǎng)液后，每孔加入10 μl CCK8溶液+200 μl對應(yīng)完全培養(yǎng)液混合液，繼續(xù)在溫箱中培養(yǎng)4 h。用酶標(biāo)儀測定在450 nm處各孔的吸光度(OD值)。每隔24 h對下一板重復(fù)以上操作，以此類推。

1.4.5細(xì)胞劃痕遷移實(shí)驗(yàn) 選取鋪滿6孔板狀態(tài)較佳的目的細(xì)胞，用1 ml槍頭比著消毒過的無菌直尺畫九格宮，線條之間相距0.5 cm，PBS洗細(xì)胞2次，去除劃下的細(xì)胞，加入無血清培養(yǎng)基。放入培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)。每隔24 h觀察細(xì)胞遷移情況。

1.4.6Transwell細(xì)胞遷移與侵襲試驗(yàn) 將冰上融化且配制好的1 mg/ml Matrigel 100 μl加入小室上層并凝固成膠狀。選取生長態(tài)勢較佳的目的細(xì)胞，按比例稀釋至5×104個(gè)/ml，加200 μl到上室，而下室加800 μl 30% FBS的全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。48 h后丟棄小室廢液， PBS沖洗及甲醇固定后，用結(jié)晶紫(0.1%)染色30 min，在清水下用棉棒頭小心拭去表面多余細(xì)胞，在40倍及100倍鏡下以交叉處為標(biāo)記選8個(gè)視野拍照。最后再用33%醋酸1 ml浸泡每個(gè)孔2 h，洗脫結(jié)晶紫后，取200 μl至96孔板測OD值。遷移實(shí)驗(yàn)除了鋪膠步驟缺省，余步驟一致。

1.4.7平板細(xì)胞克隆形成試驗(yàn) 取生長態(tài)勢較佳的細(xì)胞重懸后以300個(gè)細(xì)胞的梯度密度分別接種6孔板培養(yǎng)至細(xì)胞克隆成型大于50個(gè)/克隆集落，4%多聚甲醛固定20 min左右，用結(jié)晶紫(0.1%)染色30 min。在100倍及200倍鏡下拍照。最后再用33%醋酸1 ml浸泡每個(gè)孔2 h，洗脫結(jié)晶紫后，取200 μl至96孔板測OD值。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理通過ImageJ、GraphPad Prism 8進(jìn)行圖像處理、數(shù)據(jù)整理與統(tǒng)計(jì)分析，所有數(shù)據(jù)經(jīng)正態(tài)性及方差齊性檢驗(yàn)，對正態(tài)分布和方差齊完全隨機(jī)設(shè)計(jì)的兩組樣本的數(shù)據(jù)用兩樣本t檢驗(yàn)，就完全配對或配伍設(shè)計(jì)的樣本用配對t檢驗(yàn)，多組樣本比較用One-way ANOVA方差分析，對于具有非正態(tài)性或方差不齊的數(shù)據(jù)，使用秩和檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。以P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染對15株細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，篩選出SOX4基因最有可能發(fā)揮作用的細(xì)胞株，即基礎(chǔ)表達(dá)量較高的各類型細(xì)胞株進(jìn)行目的基因轉(zhuǎn)染(圖1A～C)，轉(zhuǎn)染效率均大于60%，且通過細(xì)胞形態(tài)及分子實(shí)驗(yàn)證實(shí)成功過表達(dá)與沉默目的基因(圖2A～C)。

圖2 目的基因轉(zhuǎn)染后表達(dá)情況統(tǒng)計(jì)圖A、B、C：轉(zhuǎn)染目的質(zhì)粒48 h，驗(yàn)證過表達(dá)與沉默SOX4對SOX4基因轉(zhuǎn)錄與翻譯的影響統(tǒng)計(jì)圖；與GFP組比較：****P<0.000 1；與NC組比較：#P<0.05，###P<0.001；1：Blank組；2：GFP組；3：NC組；4：pEX-2-SOX4組；5：siRNA803組

圖3 細(xì)胞劃痕愈合實(shí)驗(yàn)結(jié)果圖與統(tǒng)計(jì)圖A、B：16HBE及H157細(xì)胞轉(zhuǎn)染目的質(zhì)粒后，劃痕實(shí)驗(yàn)鏡下圖×40；C：16HBE細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果統(tǒng)計(jì)圖；D：H157細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果統(tǒng)計(jì)圖；與GFP組比較：*P<0.05，***P<0.001；與NC組比較：#P<0.05，###P<0.001；1：Blank組；2：GFP組；3：NC組；4：pEX-2-SOX4組；5：siRNA803組

2.2SOX4對肺癌細(xì)胞生物學(xué)功能的影響16HBE、H157細(xì)胞轉(zhuǎn)染目的質(zhì)粒后，經(jīng)細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)觀察細(xì)胞生長狀況，H157細(xì)胞pEX-2-SOX4組的細(xì)胞愈合率最高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05,n=3)，而16HBE細(xì)胞實(shí)驗(yàn)組愈合率與對照組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖3A～D)，且Transwell遷移與侵襲實(shí)驗(yàn)48 h后，可見對照組細(xì)胞遷移與侵襲數(shù)量少于pEX-2-SOX4組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05,n=3)(圖4A～F)；CCK8細(xì)胞實(shí)驗(yàn)測得48 h后隨著時(shí)間的推移(圖5)，pEX-2-SOX4組細(xì)胞增殖速率較對照組逐漸增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05,n=6)；細(xì)胞克隆實(shí)驗(yàn)證實(shí)pEX-2-SOX4組細(xì)胞克隆形成率較對照組高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05,n=3)(圖6A～E)。

2.3SOX4介導(dǎo)的EMT相關(guān)因子的機(jī)制探究通過分子實(shí)驗(yàn)在轉(zhuǎn)錄水平驗(yàn)證SOX4對肺癌細(xì)胞EMT表型促進(jìn)基因及誘導(dǎo)因子的表達(dá)影響(圖7)；利用統(tǒng)計(jì)軟件對轉(zhuǎn)染目的質(zhì)粒的各類型細(xì)胞株EMT相關(guān)因子及多通路主要因子進(jìn)行PCR數(shù)據(jù)整理與統(tǒng)計(jì)分析證實(shí)SOX4通過介導(dǎo)Wnt為代表的信號通路促進(jìn)EMT(圖8A～C)。

圖4 Transwell細(xì)胞遷移及侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果圖與統(tǒng)計(jì)圖A、B：Transwell細(xì)胞遷移及寢室實(shí)驗(yàn)結(jié)果圖 ×100；C：細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)成功遷移細(xì)胞數(shù)；D：細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)中結(jié)晶紫A570吸光值；E：細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)成功侵襲細(xì)胞數(shù)；F：細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)中結(jié)晶紫A570吸光值；與GFP組比較：*P<0.05，**P<0.01，****P<0.000 1；與NC組比較：#P<0.05，##P<0.01，###P<0.001；1：Blank組；2：GFP組；3：NC組；4：pEX-2-SOX4組；5：siRNA803組

圖5 CCK-8細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)結(jié)果統(tǒng)計(jì)圖與GFP組比較：*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001；與NC組比較：#P<0.05，##P<0.01

3 討論

SOX4參與胚胎發(fā)育與細(xì)胞命運(yùn)的調(diào)控，可通過TGF-β、Wnt通路調(diào)節(jié)細(xì)胞分化、增殖和轉(zhuǎn)移，并通過相關(guān)因子促發(fā)EMT，是人類腫瘤中普遍存在的具有標(biāo)志性意義的64個(gè)基因之一[6]。本實(shí)驗(yàn)成功培養(yǎng)了15株肺正常上皮及肺癌細(xì)胞，以SOX4基礎(chǔ)表達(dá)量為依據(jù)，篩選出SOX4表達(dá)量最高、作用最為顯著的H157肺癌細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞功能實(shí)驗(yàn)。同時(shí)，篩選SOX4表達(dá)最高的五種類型細(xì)胞各一株進(jìn)行后續(xù)機(jī)制探究。

通過過表達(dá)SOX4，細(xì)胞首先從形態(tài)上發(fā)生了轉(zhuǎn)變，由圓形、橢圓形逐步演化成長梭形，由聚集性生長，發(fā)展為趨向疏松性生長，鏡下多見散在的細(xì)胞，由此猜想細(xì)胞間的鏈接變得不再那么緊密。CCK8及平板克隆檢測過表達(dá)SOX4后細(xì)胞的增殖能力也顯著增強(qiáng)；侵襲實(shí)驗(yàn)分析SOX4過表達(dá)后細(xì)胞侵襲能力也得到了一定的加強(qiáng)。劃痕與Transwell遷移實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，過表達(dá)SOX4后，細(xì)胞的遷移能力呈現(xiàn)不同的增高，過表達(dá)SOX4能夠增強(qiáng)肺癌細(xì)胞的增殖、遷移與侵襲的能力，但正常細(xì)胞的遷移能力并不受SOX4表達(dá)的影響。本課題組在前期實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，SOX4在腫瘤細(xì)胞中的表達(dá)較正常肺組織顯著增高[7]，在體外實(shí)驗(yàn)中也發(fā)現(xiàn)SOX4的沉默，抑制了腫瘤的生物學(xué)行為[8]。本部分實(shí)驗(yàn)亦證實(shí)SOX4可通過介導(dǎo)上皮標(biāo)志物E-Cad的缺失及間質(zhì)標(biāo)志物N-Cad、纖維連接蛋白(Fibronectin, FN)及Vim和EMT相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子(Snail、Twist及β-catenin)的上調(diào)，以促進(jìn)EMT的發(fā)生。在探究其具體機(jī)制中發(fā)現(xiàn)，SOX4在不同類型的肺癌中可通過多條信號通路發(fā)揮EMT的調(diào)控作用，進(jìn)而促使腫瘤增殖、轉(zhuǎn)移與侵襲，具體如下：① 以16HBE為代表的正常肺細(xì)胞主要通過Smad7、TJP-1、TJP-2和WIF1來增強(qiáng)Wnt及TGF-β負(fù)反饋通路拮抗SOX4介導(dǎo)的EMT進(jìn)程[9-10]。② 以H446為代表的小細(xì)胞肺癌細(xì)胞主要通過SOX4促進(jìn)ADAM28加強(qiáng)ECM的降解[11]及直接或間接增加β-catenin的表達(dá)而加強(qiáng)并穩(wěn)定Wnt/β-catenin信號級聯(lián)[12]，與TGF-β通路協(xié)同參與上皮表型缺失，間質(zhì)表型上調(diào)而介導(dǎo)EMT的發(fā)生[13]。③ 以H157為代表的肺腺癌細(xì)胞機(jī)制最為復(fù)雜，SOX4促使多種EMT促進(jìn)因子上調(diào)，其中，以Twist抑制E-Cad的作用最為顯著[14]，其次，包括Notch和TGF-β等在內(nèi)的多條信號通路都加強(qiáng)了Wnt/β-catenin級聯(lián)，促進(jìn)EMT的進(jìn)展[15]。④ 以SK-MES-1為代表的肺鱗癌細(xì)胞主要通過SOX4介導(dǎo)ADAM28等因子促使ECM的降解，TGF-β、Wnt/β-catenin信號通路也有作用，但并不顯著，推測SOX4的增高負(fù)反饋引起WIF1、Smad7增多，進(jìn)而拮抗了以上通路的作用，SOX4對肺鱗癌EMT作用并不顯著。⑤ 以H460為代表的大細(xì)胞肺癌細(xì)胞主要通過SOX4介導(dǎo)Twist、Snail、Wnt2、TGF-β的上調(diào)，增強(qiáng)Wnt及TGF-β等多條信號通路促進(jìn)EMT的進(jìn)展。

圖6 細(xì)胞生物學(xué)功能實(shí)驗(yàn)結(jié)果圖與統(tǒng)計(jì)圖A：細(xì)胞克隆形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果圖 ×100/200；B：細(xì)胞克隆形成率；C：結(jié)晶紫A570吸光值；1：Blank組；2：GFP組；3：NC組；4：pEX-2-SOX4組；5：siRNA803組；與GFP組比較：*P<0.05，**P<0.01；與NC組比較：#P<0.05，##P<0.01，###P<0.001

圖7 EMT相關(guān)通路主要因子表達(dá)熱圖A：SOX4過表達(dá)和敲除后16HBE、H446、H157、SK-MES-1及H460細(xì)胞中EMT相關(guān)通路主要因子的表達(dá)熱圖；與GFP組比較，正向增加：nsP>0.05，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，****P<0.000 1；與GFP組比較，反向減少：nsP>0.05，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001

綜上，SOX4可通過影響EMT相關(guān)因子的表達(dá)促進(jìn)肺癌細(xì)胞的增殖、遷移與侵襲，Wnt及TGF-β為其主要信號通路。SOX4有望成為小細(xì)胞肺癌、肺腺癌及大細(xì)胞肺癌EMT的主要標(biāo)志物與診療的潛在靶點(diǎn)。