李 堃，劉 悅，黃 鵬，楊智昉，胡 茜，張 穎，李志宏，呂葉輝，梁 樂

分選連接蛋白 (sorting nexins, SNX)家族是進化保守的磷酸化蛋白結(jié)合蛋白，其在協(xié)調(diào)膜質(zhì)貨物分類過程中起著重要作用[1]。可將SNX分為SNX-BAR、SNX-FERM、PX only 等亞科[2]。這些蛋白質(zhì)在內(nèi)吞小泡的降解途徑中起著分選和回收貨物的重要作用。

SNX4是SNX-BAR亞科的一個成員。SNX-BAR蛋白可以通過BAR結(jié)構(gòu)域[3]的相互作用在膜表面寡聚，從而包裹膜小管。SNX4可與雙載蛋白2(amphiphysin 2)協(xié)同作用[4]，為轉(zhuǎn)鐵蛋白受體(transferrin receptor, TfR)[5]和鈣黏蛋白[6]脫離溶酶體并進入循環(huán)途徑的關(guān)鍵分子。SNX4是唯一在體外形成穩(wěn)定的同二聚體或者與SNX7或SNX30形成異二聚體的SNX家族成員[3]。SNX4通過與微管運動動力蛋白的輔激活劑KIBRA結(jié)合，誘導(dǎo)內(nèi)吞再循環(huán)小泡(endocytic recycling compartment，ETC)轉(zhuǎn)運到細胞的核周區(qū)域。該研究旨在探索SNX4在睪丸中的表達和定位，進而推測其功能。

1 材料與方法

1.1 材料選擇出生后8周雄性C57BL/6小鼠，體質(zhì)量約25 g，根據(jù)實驗分組，每組5只，由中科院上海實驗動物中心提供。TRIzol RNA抽提試劑(美國Invitrogen公司)；反轉(zhuǎn)錄試劑盒、DNA分子量標準、Premix ex-Taq(大連寶生物公司)；抗SNX4抗體、抗Rab5抗體、正常兔IgG、FITC標記羊抗兔IgG、TRITC標記羊抗大鼠IgG(美國Abcam公司)。Laminin包被培養(yǎng)皿(美國BD公司)、DMEM培養(yǎng)液中添加5%FBS、青鏈霉素雙抗(美國Gibco公司)。新鮮配制使用。DPBS、乙醚、BSA等一般化學(xué)試劑購自上海化學(xué)試劑有限公司。

1.2 方法

1.2.1小鼠睪丸SNX家族基因表達分析 抽提小鼠睪丸總RNA后，反轉(zhuǎn)錄成cDNA。按照Premix exTaq說明書，以表1所示引物在ABI7500熒光定量PCR儀上進行定量擴增。記錄CT值，用2-ΔΔCT法計算mRNA表達變化。

1.2.2小鼠各臟器SNX4基因表達分析 抽提小鼠肝臟、脾臟、腎臟、腦、睪丸總RNA后，反轉(zhuǎn)錄成cDNA。按照Premix exTaq說明書，以表1所示引物在ABI7500熒光定量PCR儀上進行定量擴增。記錄CT值，用2-ΔΔCT法計算mRNA表達變化。

1.2.3睪丸SNX4免疫組化染色 迅速取出小鼠睪丸，去除多余組織，4%多聚甲醛固定，石蠟切片，入PBS洗3次，每次15 min。用新配置的0.3% H2O2處理，室溫30 min。PBS洗3次，每次5 min。用10%山羊血清室溫封閉1 h。滴加兔抗小鼠SNX4抗體，1 ∶100稀釋，4 ℃過夜。PBS洗3次，每次5 min。陰性對照采用免疫前兔血清或正常兔血清替代一抗，在相同條件下孵育(實驗組n=5，陰性對照組n=5)。滴加羊抗兔第二抗體，1 ∶300稀釋，室溫孵育15～ 60 min。PBS洗3次，每次5 min。滴加ABC復(fù)合物，室溫15～60 min。PBS 洗3次，每次5 min。用0.01% H2O2的DAB溶液，室溫5～30 min。用蘇木精復(fù)染細胞核。鏡檢、拍照。

表1 Real-time PCR引物

1.2.4TM4細胞培養(yǎng) 37 ℃水浴快速解凍復(fù)蘇TM4細胞，加入DMEM高糖培養(yǎng)基+10% FBS+1%青鏈霉素中，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)。2～3 d換液1次，待其生長恢復(fù)穩(wěn)定后，每2 d按1 ∶3傳代1次。傳代1～3次后取生長良好的細胞用于實驗。

1.2.5TM4細胞SNX4與Rab5間接免疫熒光染色 取TM4細胞，PBS洗3次，每次3 min，用10%山羊血清室溫封閉1 h，加入兔抗小鼠SNX4單克隆抗體和大鼠抗小鼠Rab5單克隆抗體，1 ∶100稀釋，4 ℃孵育過夜。PBS洗3次，每次3 min，再加入FITC標記羊抗兔IgG，TRITC標記羊抗大鼠IgG，1 ∶300稀釋，37 ℃孵育1 h，PBS洗3次，每次3 min，甘油PBS封片。陰性對照組采用免疫前兔血清或正常兔血清替代一抗，在相同條件下孵育。激光共聚焦顯微鏡(LSM-510 laser scanning confocal microscope, Carl Zeiss)觀察并掃描成像。

2 結(jié)果

2.1 小鼠睪丸SNX家族基因表達分析如圖1所示，在小鼠睪丸中，SNX1和SNX4兩個SNX家族成員的mRNA相對表達量高于其它的家族成員，分別可以達到SNX33mRNA相對表達量的(20.94±0.05)倍(P=0.002 9，n=5)和(10.11±0.01)倍(P<0.003 4，n=5)。SNX3、SNX13、SNX14的mRNA的相對表達量可以達到SNX33的約5倍左右(P=0.033，n=5；P=0.036，n=5；P=0.038，n=5)。

圖1 小鼠睪丸SNX家族基因表達分析

2.2 小鼠各臟器SNX4基因表達分析如圖2所示，在小鼠的肝臟、脾臟、腎臟、腦和睪丸中，其中睪丸的SNX4的mRNA的相對表達量高于其他的臟器?？梢赃_到肝臟中mRNA相對表達量的(15.49±4.92)倍(P=0.0036,n=5)。其他幾個主要臟器之間SNX4 mRNA相對表達量無明顯差異。

圖2 小鼠各臟器SNX4基因表達分析

2.3 小鼠睪丸中SNX4表達定位免疫組織化學(xué)染色顯示，在小鼠睪丸中，SNX4染色主要集中在支持細胞(sustentacular cell, 又稱Sertoli細胞)中，在各級生精細胞中和間質(zhì)細胞(Leydig 細胞)中均未見明顯染色。見圖3A。

2.4 TM4細胞中SNX4和Rab5表達定位免疫熒光染色顯示，在TM4細胞中SNX4(綠色)和Rab5(紅色)定位于細胞質(zhì)中，染色呈現(xiàn)圓球點狀。并且在細胞中部近核周區(qū)域，SNX4和Rab5呈現(xiàn)共定位的狀態(tài)(黃色)。見圖3B。

3 討論

內(nèi)體系統(tǒng)的主要功能是獲取營養(yǎng)、控制蛋白質(zhì)和脂質(zhì)代謝、保護機體免受病原體侵襲，并作為細胞膜的儲藏庫，支持Sertoli細胞膜表面積的快速變化。內(nèi)吞作用將膜受體和細胞外配體進行內(nèi)吞。然后，他們進入內(nèi)體系統(tǒng)進行分選和處理。其主要途徑有：① 分子經(jīng)早期內(nèi)體發(fā)育成晚期內(nèi)體，最終到溶酶體進行降解。② 分子由囊泡和管狀運輸載體介導(dǎo)，運送到目的地。其中“循環(huán)”途徑(recycling)將分子從內(nèi)體傳輸?shù)劫|(zhì)膜，而“逆行”途徑(retrograde)將分子從內(nèi)體傳輸?shù)礁郀柣w，從而遠離降解途徑[7]。

SNX家族成員在內(nèi)體分選轉(zhuǎn)運過程中發(fā)揮重要作用。所有的SNX家族成員都含有一個PX區(qū)域(PX domain)，PX結(jié)構(gòu)域?qū)辛字＜〈嫉膬?nèi)體膜具有特異性。有研究[8]表明SNX家族成員SNX16與乳腺癌細胞的遷移和侵襲有關(guān)。

圖3 SNX4在睪丸和TM4細胞中的定位 ×40A:SNX4在睪丸中免疫組織化學(xué)；B:SNX4和Rab5在TM4細胞中的免疫熒光染色，上排3個圖為單個TM4細胞免疫熒光染色，圖中比例尺為20 μm；下排3個圖為共定位區(qū)域的局部放大圖像，圖中比例尺為10 μm

在SNX的眾多家族成員中，睪丸中SNX1和SNX4的表達高于其他的家族成員。SNX1往往和SNX5或者SNX6形成二聚體而作為retromer的重要組成部分[9]，在磷酸甘露糖受體，分揀相關(guān)受體L(SORLA)，Wnt 信號因子(Wls)和二價金屬轉(zhuǎn)運受體(DMT1)等受體從內(nèi)體到高爾基體的轉(zhuǎn)運[10-11]起重要作用。實驗結(jié)果顯示，睪丸中SNX5的表達量相對較低，推測睪丸中SNX1和SNX6形成二聚體而參與物質(zhì)的“逆行”途徑。

該實驗結(jié)果表明，睪丸中SNX4的表達高于肝臟、脾臟、腎臟和腦。這提示在睪丸中表達的SNX4可能參與了睪丸中特有的物質(zhì)轉(zhuǎn)運，并且睪丸中SNX4定位于Sertoli細胞的胞質(zhì)中。

Sertoli細胞不僅為生精細胞提供營養(yǎng)和支持作用，并且為精原細胞遷移、增殖、分化、精子發(fā)生、精子變形及結(jié)構(gòu)成熟等活動提供必要的微環(huán)境。研究[12-13]表明，細胞內(nèi)吞作用(endocytosis)是調(diào)節(jié)Sertoli細胞連接的重要途徑。在雄激素和細胞因子(如TNF-α、TGF-β2、TGF-β3)的作用下，Sertoli細胞通過細胞內(nèi)吞作用清除細胞連接處的連接蛋白，從而“打開”細胞連接結(jié)構(gòu)。這些含有連接蛋白的內(nèi)吞小泡可以與早期內(nèi)體融合形成內(nèi)體[14]。然后，根據(jù)不同信號的調(diào)控，雄激素可以促進內(nèi)體再循環(huán)[15]，將連接蛋白運輸至細胞膜，形成新的細胞連接；而TGF-β、TNF-α信號則促進內(nèi)體與溶酶體融合[12-13]，降解連接蛋白，從而有利于清除細胞連接結(jié)構(gòu)。在生精周期中，Sertoli細胞通過調(diào)節(jié)細胞內(nèi)吞及后續(xù)囊泡運輸?shù)姆较?，既保證了細胞連接周期性的“開放”，又維持了正常的血睪屏障功能。

免疫熒光染色顯示，SNX4和Rab5在Sertoli細胞系中共定位于中部近核周區(qū)域。提示SNX4可能定位于早期內(nèi)體，并且可能參與了早期內(nèi)體的成熟和早期內(nèi)體中部分分子的再循環(huán)利用。

綜上所述，在小鼠睪丸中，SNX4高表達，定位于Sertoli細胞并且與早期內(nèi)體的標志物Rab5具有共定位的特性。