徐紹蓮，何曉剛，張 露，汪 剛，羅 濤，徐曉丹，徐曉軍，3，李菲菲

研究乳腺癌的發(fā)生機制至關(guān)重要。目前，越來越多的研究顯示，miRNA的異常表達與乳腺癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[1]。微小RNA(microRNA, miR)是一類由19～25個核苷酸組成的非編碼小RNA，廣泛存在于植物、動物和病毒中。 miRNA通過調(diào)控多種基因表達，參與細胞增殖、分化和凋亡等多種生理過程，在腫瘤發(fā)生、發(fā)展中具有重要的作用。其中miR-100異常表達對腫瘤發(fā)生、發(fā)展的作用受到了人們的廣泛的關(guān)注[2]。miR-100位于11號染色體上，長度為22個核苷酸組成[3]。有研究[4-5]表明miR-100可以通過靶向不同分子如哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin，mTOR)、保羅樣激酶1(polo-like kinase 1，PLK1)、swi/snf相關(guān)基質(zhì)相關(guān)的肌動蛋白依賴性染色質(zhì)亞群調(diào)節(jié)因子5(SWI/SNF-related matrix-associated actin-dependent regulator of chromatin subfamily A member 5，SMARCA5)等來調(diào)節(jié)腫瘤細胞凋亡、自噬、增殖和遷移，干細胞自我更新和藥物敏感性。但它是否對正常細胞存在惡性轉(zhuǎn)化效果尚不清楚。課題組前期的研究顯示miR-100在正常乳腺組織中較高，而在乳腺癌患者的癌組織標本中明顯表達下調(diào)，miR-100的缺失可能與乳腺細胞向乳腺癌細胞的惡性轉(zhuǎn)化有關(guān)。故現(xiàn)通過分析比較組織和細胞水平miR-100的表達差異，探討miR-100表達水平改變對正常乳腺上皮細胞和乳腺癌細胞增殖能力的直接影響。

1 材料與方法

1.1 細胞和主要試劑miR-100擬態(tài)片段慢病毒表達載體(lentiviral vector 3 of miR-100 mimics，LV3-miR-100 mimics)，miR-100拮抗片段慢病毒表達載體(lentiviral vector of miR-100 inhibitor，LV3-miR-100 inhibitor)以及相應(yīng)的模擬片段和拮抗片段的病毒陰性對照組(negative control，NC)均為100 μl/tube，滴度為109TU/ml，由上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司制造。永生化的正常乳腺上皮細胞MCF-10A、人乳腺癌細胞MCF-7、MB-231細胞(三陰性人乳腺癌MB-231腺癌細胞系)(安徽醫(yī)科大學(xué)病理學(xué)與病理生理學(xué)教研室常規(guī)培養(yǎng)的細胞種類)。嘌呤霉素(Puromycin)購自上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司。

1.2 實驗分組MCF-10A細胞分為MCF-10A對照組(Control，正常對照組)、轉(zhuǎn)染陰性慢病毒載體組(Negative control，NC對照組)、下調(diào)miR-100表達即miR-100 inhibitor 轉(zhuǎn)染組(inhibitor)。MCF-7細胞分為MCF-7對照組(Control，正常對照組)、轉(zhuǎn)染陰性慢病毒載體組(Negative control，NC對照組)、上調(diào)miR-100表達即miR-100 mimics 轉(zhuǎn)染組(mimics)。

1.3 miRNA慢病毒感染建立穩(wěn)定細胞系感染前1 d將狀態(tài)良好的且處于快速生長期的細胞進行常規(guī)處理，離心重懸后進行細胞計數(shù)、鋪板。細胞數(shù)以次日轉(zhuǎn)染慢病毒載體時，24孔板孔中細胞密度達到40%，按4×104/孔鋪板。轉(zhuǎn)染效率最好的為MCF-10A細胞，其MOI值為10(病毒滴度為1E+7TU/ml)。轉(zhuǎn)染病毒前，用PBS清洗吸取的培養(yǎng)基1次，病毒提前從 -80 ℃冰箱中取出并融化，使用前進行離心處理。將10 μl LV- miR-100 mimics或 LV- miR-100 inhibitor、150 μl 二醇甲醚(proprylene glycol monomethyl ether，PM)、340 μl DMEM-F12完全培養(yǎng)基混勻后加入24孔板中，并設(shè)1個復(fù)孔。感染NC慢病毒組操作相同。感染8 h后，將培養(yǎng)基全部吸取并加入DMEM-F12完全培養(yǎng)基。加入慢病毒60 h后，熒光倒置顯微鏡下觀察細胞狀態(tài)和熒光表達情況，再用嘌呤霉素篩選穩(wěn)定的細胞株。

1.4 q-PCR檢測MB-231、MCF-7和MCF-10A細胞中miR-100的表達RNA提取按照安徽醫(yī)科大學(xué)病理學(xué)與病理生理學(xué)實驗室常規(guī)操作進行，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA作為下一步q-PCR反應(yīng)模板，將反應(yīng)管放入ABI7500熒光定量PCR儀中，先95 ℃ 、3 min后，進行以下反應(yīng)程序：95 ℃、12 s， 62 ℃、40 s，總共40個循環(huán)；選用染料SYBR檢測熒光基團，62 ℃進行檢測。以U6為內(nèi)參，Ct為循環(huán)數(shù)，ΔCt為miR-100的循環(huán)數(shù)與U6循環(huán)數(shù)之差，ΔΔCt=miR-100ΔCt一校正樣品△Ct，用2-ΔΔCt法計算miR-100的相對表達量。

1.5 MTT檢測細胞活力將狀態(tài)良好的且處于快速生長期的MCF-10A、MCF-7細胞常規(guī)細胞處理，離心重懸后取20 μl細胞懸液計數(shù)。調(diào)整細胞數(shù)為10 000/ml，在96孔板中以3 000個/孔細胞鋪板，各組細胞設(shè)5個復(fù)孔，每孔培養(yǎng)液體積為200 μl。待細胞貼壁伸展后，在避光的環(huán)境下，將Formazan溶解液和MTT試劑以4 ∶1的比例混勻后，向?qū)嶒灴缀驼{(diào)零孔加入50 μl/孔。培養(yǎng)箱孵育4 h后收板，利用酶標儀在490 nm檢測各孔細胞的吸光度。

1.6 平板克隆實驗檢測細胞克隆形成能力選狀態(tài)良好的且處于快速生長期的MCF-10A、MCF-7細胞進行常規(guī)細胞處理，離心重懸成單個細胞懸液后，取20 μl細胞懸液計數(shù)。調(diào)整細胞數(shù)為10 000/ml。在6孔板中以500個/孔細胞鋪板，各組細胞設(shè)2個復(fù)孔，每孔培養(yǎng)液體積為2 ml。吸取相應(yīng)細胞數(shù)的細胞懸液加于6孔板中。 培養(yǎng)10～14 d終止培養(yǎng)。多聚甲醛結(jié)晶紫溶液染色1 h、室溫晾干、拍照、計數(shù)，計算克隆形成的比例(克隆數(shù)目/500×100%)。

2 結(jié)果

2.1 miR-100在組織學(xué)和細胞學(xué)水平的表達譜從安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院乳腺外科收取38例臨床新鮮的乳腺癌組織和癌旁組織標本。通過原位雜交檢測乳腺癌組織和癌旁組織中miR-100的表達，結(jié)果顯示癌旁組織中miR-100的表達明顯高于癌組織，如圖1，棕染顆粒所示為陽性表達。

通過q-PCR實驗，檢測miR-100在乳腺癌細胞MB-231、MCF-7和正常乳腺上皮細胞MCF-10A的表達情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)miR-100在乳腺癌和正常乳腺上皮細胞中的表達存在顯著差異，miR-100在乳腺上皮細胞中的表達量最高，而在乳腺癌細胞系MCF-7和MB-231中明顯降低，并且在惡性程度較高的MB-231中最低。兩兩比較結(jié)果顯示，兩株癌細胞與正常細胞比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(t=3.10、3.19，P<0.05)，MCF-7與MB-231比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(t=0.09，P=0.945)。見圖2。

圖1 原位雜交檢測miR-100在乳腺癌組織和癌旁組織中表達差異

2.2 建立穩(wěn)定高表達miR-100乳腺癌細胞株和低表達miR-100乳腺上皮細胞株由于miR-100在MCF-10A細胞中的表達高于MCF-7細胞。因此，在MCF-10A細胞中轉(zhuǎn)染miR-100 inhibitor的慢病毒載體(圖3A)，在MCF-7細胞中轉(zhuǎn)染miR-100 mimics的慢病毒載體(圖3B)。結(jié)果表明：轉(zhuǎn)染了miR-100 inhibitor的MCF-10A細胞中，miR-100的表達水平明顯低于對照組(圖3C)；而轉(zhuǎn)染miR-100 mimics的MCF-7細胞中，miR-100的表達水平明顯高于對照組(圖3D)。上述結(jié)果顯示，通過慢病毒轉(zhuǎn)染的方式構(gòu)建了穩(wěn)定下調(diào)miR-100表達的MCF-10A細胞株和穩(wěn)定上調(diào)miR-100表達的MCF-7細胞株。

圖2 miR-100在正常乳腺上皮細胞和乳腺癌細胞中的表達差異與正常乳腺上皮細胞MCF-10A比較：*P<0.05

2.3 miR-100可以抑制細胞活力MTT實驗結(jié)果表明：下調(diào)MCF-10A細胞中miR-100的表達促進細胞的活力(圖4A)；而在MCF-7細胞中過表達miR-100后，細胞的活力與對照組比較明顯降低(圖4B)。上述實驗結(jié)果顯示，下調(diào)miR-100的表達促進乳腺上皮細胞活力，上調(diào)miR-100的表達可能抑制乳腺癌細胞的活力。

2.4 miR-100負調(diào)控克隆形成能力細胞克隆形成實驗檢測細胞克隆形成能力。接種細胞于6孔板中，15 d后收板。結(jié)果顯示，與對照組相比，下調(diào)miR-100的表達，促進MCF-10A克隆數(shù)目和體積，促進其克隆形成能力。促進miR-100的表達，抑制了MCF-7細胞的克隆大小和數(shù)目，見圖5A、B。

3 討論

腫瘤細胞的惡性轉(zhuǎn)化通過多步驟過程發(fā)生，該過程涉及多重功能性和表觀遺傳學(xué)調(diào)控，這也被認為是干預(yù)治療面臨最具挑戰(zhàn)性的問題之一[6]。最近多個關(guān)于microRNA參與腫瘤發(fā)生的研究已經(jīng)表明這些非編碼小RNA在細胞惡性轉(zhuǎn)化中起重要作用[7-10]。乳腺癌的發(fā)生機制復(fù)雜，其中正常乳腺上皮細胞如何發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化導(dǎo)致乳腺癌發(fā)生發(fā)展的機制仍不很清楚。近年來研究發(fā)現(xiàn)miRNA參與癌基因上調(diào)、抑癌基因下調(diào)或失活、細胞增殖、侵襲能力增強、干性增強等起到重要作用[11-14]。如前所述，miR-100在多個腫瘤的發(fā)生發(fā)展中具有重要作用，但在乳腺癌的發(fā)生發(fā)展尤其是對正常乳腺細胞的惡性轉(zhuǎn)化作用機制尚不明。

圖5 miR-100對MCF-10A、MCF-7細胞平板克隆形成能力和集落形成能力的影響A：miR-100對MCF-10A細胞平板克隆形成能力和集落形成能力的影響； B：miR-100對MCF-7細胞平板克隆形成能力和集落形成能力的影響; 與control和NC兩個對照組比較：*P<0.05

本實驗研究中首先建立穩(wěn)定下調(diào)miR-100表達的乳腺上皮細胞株和上調(diào)miR-100的乳腺癌細胞株。通過體外實驗檢測miR-100的不同表達水平對MCF-10A和MCF-7細胞生物學(xué)功能的影響；結(jié)果顯示，下調(diào)miR-100的表達促進MCF-10A細胞的活力以及克隆形成能力；上調(diào)miR-100的表達抑制 MCF-7細胞的活力以及克隆形成能力。

結(jié)果表明：一方面miR-100作為一種抑癌分子，其缺失或功能抑制可能是乳腺上皮細胞發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化，促進乳腺癌發(fā)生的潛在重要分子機制；另一方面，在乳腺癌細胞中增加其表達有抑制腫瘤惡性行為的作用，提示其可以成為治療乳腺癌的潛在有效靶點。但是，miR-100在乳腺細胞中究竟通過靶向何種基因?qū)е铝艘陨细淖?，本研究尚未涉及?由于乳腺癌細胞來源可能與普通細胞發(fā)生EMT轉(zhuǎn)化成具有“干性”的細胞有關(guān)[15-16]，本課題組在實驗過程中也觀察到下調(diào)miR-100的表達，細胞的形態(tài)呈現(xiàn)梭形，顯示間質(zhì)樣形態(tài)。提示下調(diào)miR-100可以促進EMT的發(fā)生而發(fā)揮惡性轉(zhuǎn)化作用。課題組將在后續(xù)研究中進一步探討。本研究為今后以miR-100為核心，發(fā)現(xiàn)有效治療乳腺癌、干預(yù)高危人群發(fā)生乳腺癌及阻止乳腺癌發(fā)生侵襲轉(zhuǎn)移提供了重要的思路和研究方向。