宋 冰，王永樂(lè)，章晶晶，施冬健，陳明清

(江南大學(xué)化學(xué)與材料工程學(xué)院，江蘇 無(wú)錫 214122)

隨著癌癥發(fā)病率的逐年上升，開發(fā)具有優(yōu)異性能的阿霉素類藥物載體在生物醫(yī)用中具有重要的意義與廣闊的應(yīng)用前景[1-4]。近年來(lái)，由于含兒茶酚基的多巴胺(DA)具有自聚合性、優(yōu)異的生物相容性、粘附性、可再反應(yīng)性等性能而受到廣泛關(guān)注，其聚合物聚多巴胺(PDA)常被作為藥物載體。Cheng等[8]在PDA修飾的介孔二氧化硅納米粒子表面引入了靶向聚(乙二醇)-葉酸(PEG-FA)聚合物，有效提高了藥物負(fù)載率，提高了抗腫瘤能力。Tao等[9]通過(guò)邁克爾加成反應(yīng)將帶有親核官能團(tuán)的配體(如胺和硫醇)與PDA結(jié)合，制備得到新型的藥物載體搭載紫杉醇用作乳腺癌治療的靶向藥物載體。其他多項(xiàng)研究也證明了PDA 修飾后的聚合物/納米材料具有較好的藥物包封率和藥物可控釋放性[10-12]。中空的納米粒子具有更大的空腔，因而，如能制備穩(wěn)定的中空PDA納米粒子，則能進(jìn)一步提高藥物包封率。

據(jù)此，本研究構(gòu)筑以聚多巴胺(PDA)為主要結(jié)構(gòu)的納米顆粒(如圖1所示)，根據(jù)課題組先前的工作[13]通過(guò)犧牲模板法來(lái)制備中空的聚多巴胺(HPDA)納米粒子，為提高聚多巴胺納米粒子在水中的分散穩(wěn)定性，采用殼聚糖來(lái)改變聚多巴胺納米粒子的親水性，利用巰基化合物易與聚多巴胺可發(fā)生邁克爾加成反應(yīng)的特點(diǎn)，在合成巰基殼聚糖(CS-SH)的基礎(chǔ)上，制備殼聚糖包裹的中空聚多巴胺HPDA@CS復(fù)合納米粒子；通過(guò)負(fù)載抗癌藥物阿霉素，探究阿霉素的體外釋放行為與特點(diǎn)，找到最符合該體系的藥物釋放模型，為潛在的應(yīng)用提供理論依據(jù)。

圖1 合成路線示意圖

1 實(shí) 驗(yàn)

1.1 原料與儀器

正硅酸四乙酯(APBA)，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(EDC·HCl)、鹽酸多巴胺(DA·HCl)、巰基丙酸(MPA)、半胱氨酸鹽酸鹽(Cys)及1-羥基苯并三唑(HOBt)，阿拉丁試劑(上海)有限公司；鹽酸阿霉素(DOX·HCl)，卡通舒生化科技有限公司；低粘度殼聚糖(CS)，麥克林生化科技有限公司。

HJ-6多頭磁力攪拌器，金壇市醫(yī)療儀器廠；RW20 digital頂置式機(jī)械攪拌器，上海人和科學(xué)儀器有限公司；DZG-6050D真空干燥箱，上海森信實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；AL104電子天平，梅特勒-托利多儀器有限公司；Coolsafe 110-4冷凍干燥機(jī)，環(huán)球分析測(cè)試儀器有限公司；GZX-GF101-2-S電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱，上海躍進(jìn)醫(yī)療器械有限公司；Nicolet iS50 FTIR全反射傅立葉紅外光譜儀，美國(guó)尼高力儀器公司；AVANCEⅢ 400 MHz核磁共振，德國(guó)布魯克公司；S-4800場(chǎng)發(fā)射掃描電子顯微鏡，日本日立公司；JEM-2100Plus透射電子顯微鏡，日本電子株式會(huì)社；ZetaPALS Zeta電位及納米粒度分析儀，美國(guó)布魯克海文儀器公司；TU-1901紫外-可見光分光光度計(jì)，北京普析通用公司。

1.2 HPDA納米粒子的制備

首先采用stober合成法制備二氧化硅納米粒子(SiO2)。具體如下：將1 mL正硅酸四乙酯加入含有2 mL氨水、10 mL去離子水和100 mL乙醇的混合液中，反應(yīng)3 h后停止攪拌，產(chǎn)物離心，用去離子水洗三遍，放入真空干燥箱干燥48 h，制得SiO2粒子。

取100 mg的SiO2納米粒子分散于30 mL去離子水中，稱取60 mg的鹽酸多巴胺分散于上述溶液中，再加入200 μL NaOH(1M)溶液，混合液即變?yōu)楹谏?，室溫下磁力攪拌反?yīng)12 h后離心分離，產(chǎn)物用去離子水洗滌三次，冷凍干燥。

最后，將干燥完成的產(chǎn)物分散于30 mL去離子水中，量取500 μL的氫氟酸，充分混合反應(yīng)2 h，離心洗滌三次，冷凍干燥，即得空心的聚多巴胺納米粒子。

同時(shí)，實(shí)心聚多巴胺納米粒子(PDA)在無(wú)SiO2模板的NaOH溶液中制備，其實(shí)驗(yàn)方法同上。

1.3 CS-SH的制備

稱取500 mg殼聚糖(CS，Mw=5000)與350 mg 1-羥基苯并三唑(HOBt)溶于40 mL去離子水中，滴加少量鹽酸至CS完全溶解；量取 500 μL(625 mg)巰基丙酸，500 mg EDAC(1-乙基-(3-二甲氨基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽)加入CS溶液中，并用NaOH溶液調(diào)節(jié)pH至5并保持恒定，避光反應(yīng)3 h后，用3.5 kDa的透析袋透析先后在5 mmol/L鹽酸和1wt% NaCl中透析三天以除去反應(yīng)中未完全反應(yīng)的巰基丙酸，最后再用1 mmol/L 的鹽酸溶液透析24 h，冷凍干燥得到白色產(chǎn)物。

圖2 巰基丙酸接枝殼聚糖的合成

1.4 HPDA@CS復(fù)合納米粒子的制備

稱取6 mg HPDA納米粒子溶于30 mL的Tris-HCl(pH 8.5)緩沖溶液中，超聲分散30 min，再將6 mg CS-SH溶于上述溶液中，反應(yīng)12 h，離心并干燥。

同樣，實(shí)心PDA與CS-SH復(fù)合粒子也用同樣的方法制備得到。

1.5 阿霉素載藥實(shí)驗(yàn)及體外釋放

稱取5 mg鹽酸阿霉素溶于50 mL現(xiàn)配的PBS溶液中(pH 7.4)，配制得0.1 mg/mL的鹽酸多巴胺溶液，避光存放；分別稱取4 mg的空心和實(shí)心的聚多巴胺基納米粒子溶于4 mL上述配制的溶液中避光攪拌6 h，反應(yīng)結(jié)束后離心保存上清液，再使用配制的pH為7.4的PBS緩沖溶液離心洗滌一次，除去未負(fù)載的阿霉素分子。阿霉素藥物的釋放實(shí)驗(yàn)在37 ℃下于pH為7.4的PBS緩沖溶液中進(jìn)行，每隔1 h，2.5 h，4.5 h，9 h，9 h定時(shí)進(jìn)行離心取上清液，沉淀物再重新分散于新的PBS緩沖溶液中。

2 結(jié)果與討論

2.1 巰基殼聚糖的結(jié)構(gòu)分析

圖3 殼聚糖接枝巰基丙酸的1H NMR圖譜(a)和巰基殼聚糖與殼聚糖的紅外譜圖(b)

通過(guò)邁克爾加成反應(yīng)將巰基丙酸接枝到殼聚糖分子鏈中，用核磁和紅外對(duì)其結(jié)構(gòu)進(jìn)行表征。圖3a所示的1H NMR譜圖中化學(xué)位移為3～4之間的是殼聚糖上氫原子的峰，位于2.7附近的是巰基丙酸上亞甲基的峰，經(jīng)過(guò)積分計(jì)算巰基丙酸的接枝率為3.7%；紅外譜圖(圖3b)分別是CS、CS-SH，其中CS-SH在1510 cm-1處具有明顯的吸收峰，歸屬于酰胺鍵上羰基的振動(dòng)吸收峰，表明成功將巰基丙酸接枝到殼聚糖中。

2.2 納米粒子的形貌

圖4 SiO2(a)，SiO2 @ PDA(b)，HPDA-CS(c)的SEM照片和SiO2(d)，SiO2 @ PDA(e)，HPDA(f)的TEM照片

從圖4分別是納米粒子的SEM和TEM照片，圖4a、4d顯示制備的SiO2為直徑為100 nm左右的球形粒子。DA在其表面自聚合形成PDA殼，因而其表面變得粗糙(圖4b)，從圖4e的TEM圖中可以明顯看到SiO2@PDA為核殼結(jié)構(gòu)，外層為PDA層，由此可以計(jì)算PDA層約為25 nm。用HF去除SiO2模板后，圖4f顯示其為中空結(jié)構(gòu)的HPDA。當(dāng)在HPDA外層包覆殼聚糖后，如圖4c所示，納米粒子表面變得不規(guī)整，粒徑與HPDA的基本保持不變。

2.3 載藥性能

通過(guò)紫外分光光度計(jì)建立阿霉素溶液濃度對(duì)吸光度的關(guān)系，將阿霉素溶于pH為7.4的PBS溶液中，配置一系列不同濃度的阿霉素溶液；檢測(cè)其230 nm的特征吸收峰，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線，其回歸方程為A=14.96c(R2=0.99703)為吸光度和濃度的關(guān)系式。

包封率(ER)和載藥量(DL)是考察藥物載體性能的一個(gè)重要指標(biāo)，它能直接反應(yīng)出藥物載體能負(fù)載藥物的量，ER和DL的計(jì)算公式如下所示：

本次試驗(yàn)中均采用4 mL 0.1 mg/mL的阿霉素溶液，故上式中W為0.4 mg；W0為上層清液中剩余的藥物量，即負(fù)載到載體上的藥物量，通過(guò)對(duì)比負(fù)載前后阿霉素溶液的吸光度的變化即可計(jì)算得出；W載為藥物載體的質(zhì)量，4 mg；將實(shí)心PDA納米粒子標(biāo)記為A組，HPDA納米粒子標(biāo)記為B組。經(jīng)過(guò)計(jì)算：PDA對(duì)藥物的包封率為17.4%、載藥量為1.74%；而HPDA包封率為21.6%、載藥量為2.16%，如圖5所示，說(shuō)明空心納米粒子較大的空腔而使其具有更大的載藥效率。

圖5 不同類型的藥物載體的包封率

2.4 釋放性能

測(cè)量不同濃度梯度的阿霉素溶液吸光度，PDA(A)、HPDA(B)與阿霉素溶液混合攪拌之后，測(cè)量離心所得上清液吸光度，測(cè)量在藥物載體PBS緩沖溶液中相隔一定時(shí)間進(jìn)行離心所得上清液的吸光度。表1為離心所得上清液藥物濃度隨時(shí)間變化表，上清液累積藥物釋放量由上清液濃度與體積的乘積計(jì)算得出，并與負(fù)載的藥物量計(jì)算得出圖6所示累積釋放百分比與時(shí)間的折線圖。

表1 離心所得上清液藥物濃度隨時(shí)間變化表

圖6 載體PDA(A)和HPDA(B)負(fù)載的阿霉素的體外釋放百分比

藥物的釋放一般遵循4種數(shù)學(xué)模型[14]，如表2所示，根據(jù)HPDA(載體B)的釋放百分比計(jì)算得出擬合方程。

表2 根據(jù)載體B累積釋放百分比的數(shù)據(jù)擬合出來(lái)的四個(gè)模型方程

圖8 四個(gè)動(dòng)力學(xué)模型針對(duì)載體B的阿霉素體外累計(jì)釋放百分比擬合出的曲線與實(shí)際載體B的阿霉素體外累計(jì)釋放百分比

根據(jù)載體B累積釋放百分比擬合出來(lái)的四個(gè)模型方程繪制曲線與載體A和B所繪制出的藥物累計(jì)釋放量占載藥量的百分比繪制圖像比較、匹配可以判斷出雙相動(dòng)力曲線方程是最符合載體B累計(jì)釋放量占載藥量的百分比。雙相動(dòng)力方程符合聚多巴胺復(fù)合納米粒子為載體時(shí)阿霉素體外釋放模型，即在釋放初期，由于pH值的變化，導(dǎo)致納米粒子的結(jié)構(gòu)相應(yīng)的發(fā)生變化，負(fù)載在其上的阿霉素此時(shí)會(huì)大量的釋放出來(lái)，即形成了一定的突釋效應(yīng)；當(dāng)釋放進(jìn)行到一定程度，此時(shí)聚多巴胺復(fù)合納米顆粒會(huì)有一個(gè)緩釋作用，降低藥物的釋放速率；同時(shí)載體A和載體B作比較時(shí)可以發(fā)現(xiàn)，實(shí)心的聚多巴胺復(fù)合納米顆粒在釋放初期的釋放速率會(huì)略大于空心的聚多巴胺復(fù)合納米顆粒，但是實(shí)心的聚多巴胺納米粒子的釋放更加的緩和，在釋放后期，同等時(shí)間內(nèi)空心的聚多巴胺復(fù)合納米顆粒能夠釋放出更多的阿霉素。推測(cè)可能是由于空心的聚多巴胺復(fù)合納米顆粒在其腔室內(nèi)能夠容納一定量的阿霉素分子，在釋放后期能夠源源不斷的釋放阿霉素分子；同時(shí)由于有空腔的存在，空心的聚多巴胺復(fù)合納米顆粒也能夠負(fù)載更多的阿霉素分子。

3 結(jié) 論

以二氧化硅納米粒子為模板制備得到中空PDA納米粒子，巰基化殼聚糖能通過(guò)邁克爾加成接到HPDA表面得到聚多巴胺復(fù)合納米顆粒，提高聚多巴胺納米粒子穩(wěn)定性。負(fù)載到HPDA的阿霉素可在PBS緩沖溶液中緩慢釋放，符合雙相動(dòng)力學(xué)方程。并且通過(guò)對(duì)比實(shí)心聚多巴胺復(fù)合納米顆粒作為載體時(shí)和空心的聚多巴胺復(fù)合納米顆粒在載藥量、包封率以及釋放特點(diǎn)進(jìn)行了比較，發(fā)現(xiàn)空心聚多巴胺復(fù)合納米顆粒相比較實(shí)心聚多巴胺復(fù)合納米顆粒的各項(xiàng)性能均有不同程度的提高，在關(guān)于阿霉素的體外釋放時(shí)，由于有空腔的存在，相當(dāng)于有一個(gè)口袋般的存在使阿霉素的釋放更加的緩和，相比較而言，實(shí)心的聚多巴胺復(fù)合納米顆粒一開始突釋作用很明顯，在1 h內(nèi)，釋放量就已經(jīng)達(dá)到了35%，后續(xù)釋放就明顯不如空心的聚多巴胺復(fù)合納米顆粒。