宋 蕓，鐘 霞，陳年根

(海南醫(yī)學(xué)院，海南省熱帶藥用植物研發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，海南 ?？?571199)

布舍瑞林(Buserelin)是促性腺激素釋放激素(LH-RH)激動(dòng)劑類似物，為人工合成的線性九肽，其氨基酸序列為pGlu-His-Trp-Ser-Tyr-D-Ser(But)-Leu-Arg-Pro-NHEt(焦谷氨酸-組氨酸-色氨酸-絲氨酸-酪氨酸-(O-叔丁基)-D-絲氨酸-亮氨酸-精氨酸-脯氨酸-乙胺基)。化學(xué)結(jié)構(gòu)式見(jiàn)圖1。

圖1 布舍瑞林的化學(xué)結(jié)構(gòu)式

布舍瑞林劑型分為注射劑、鼻噴劑和植入劑三種，臨床用于治療前列腺癌、乳腺癌、子宮內(nèi)膜異位癥和子宮肌瘤等。目前，布舍瑞林原料藥及其制劑均未進(jìn)入中國(guó)。

布舍瑞林的合成方法主要包括固相合成、液相合成和固-液結(jié)合合成三種方法。固相合成方法中[1-4]，保護(hù)氨基酸和縮合試劑需要三倍過(guò)量或更多，氨基酸浪費(fèi)較多，合成成本大。并且在最后的切肽工序中，6-位絲氨酸側(cè)鏈?zhǔn)宥』苋菀自谒嵝詶l件下被脫除而生成其它雜質(zhì)，反應(yīng)收率較低。固相合成僅在最后一步進(jìn)行純化工序，粗品的純度和肽含量均較低，給分離純化帶來(lái)很大的困難。

固-液結(jié)合合成布舍瑞林方法中，文獻(xiàn)[5]用固相方法合成三肽片段H-D-Ser(But)-Leu-Arg(HCl)-OH，而另一種方法[6]合成七肽片段Pyr-His-Trp-Ser-Tyr-D-Ser(But)-Leu-OH，兩種方法均使用TFA/DCM 體系進(jìn)行多肽從樹(shù)脂上切割。此多肽切割方法容易使6-位絲氨酸側(cè)鏈?zhǔn)宥』摮档头磻?yīng)收率，后續(xù)分離純化困難。

文獻(xiàn)[7]報(bào)道了全液相5+4片段縮合合成布舍瑞林方法，氨基酸的氨基采用了Fmoc保護(hù)方式，其脫除采用25%哌啶/DMF 溶液。哌啶屬于劇毒化學(xué)品，大量使用會(huì)造成嚴(yán)重的環(huán)境污染。

文獻(xiàn)[8]采用4+3+2液相片段縮合法。而文獻(xiàn)[9]采用(2+2)+(3+2)的液相片段合成策略。這兩種方法均采用疊氮化合物法進(jìn)行肽片段的縮合，疊氮物法操作危險(xiǎn)，需要零下40 ℃以下低溫，因此不適合產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)。

專利EP1008656[10]報(bào)道了另一種液相3+2+4合成布舍瑞林的方法，此方法的創(chuàng)新點(diǎn)在于使用了蛋白酶催化劑，但所得產(chǎn)物很難純化。

本文目的是為了克服現(xiàn)有合成路線的缺陷，提供一種保護(hù)氨基酸和縮合劑來(lái)源豐富、反應(yīng)條件溫和、適合放大生產(chǎn)、收率高、純化簡(jiǎn)便的布舍瑞林新合成方法，其合成路線如圖2所示。

圖2 布舍瑞林的合成路線

1 實(shí) 驗(yàn)

1.1 儀器與試劑

儀器：RP-HPLC型高效液相色譜儀，Waters公司；三重四極桿質(zhì)譜儀，賽默飛世爾科技；Bruker ARX-400核磁共振波譜儀，瑞士Bruker；真空冷凍干燥機(jī)，北京博醫(yī)康實(shí)驗(yàn)儀器有限公司。

試劑：pGlu、Fmoc-His(Trt)、Fmoc-Trp、Fmoc-Ser(But)、Fmoc-Tyr(Bzl)、Fmoc-D-Ser(But)、Fmoc-Leu、Fmoc-Arg(NO2)、Fmoc-Pro、2-Cl-Trt-樹(shù)脂、N-甲基嗎啉(DIEA)、1-羥基苯并三氮唑(HOBT)、苯并三氮唑-N,N,N’,N’-四甲基脲六氟磷酸酯(HBTU)、N,N’-二環(huán)己基碳二亞胺(DCC)，上海吉爾生化有限公司；三氟乙酸(TFA)，Sigma公司；乙腈、二氯甲烷(DCM)、N,N-二甲基甲酰胺(DMF)、異丙醇和哌啶，北京百靈威化學(xué)試劑有限公司。

1.2 方 法

1.2.1 Fmoc-Ser(But)-OH和Fmoc-Pro-OH分別與2-Cl-Trt樹(shù)脂的連接

精確稱取2-Cl-Trt樹(shù)脂加入固相反應(yīng)器中，并加入DMF浸泡30 min，而后依次加入Fmoc- Ser(But)-OH，苯并三氮唑-N,N,N’,N’-四甲基脲六氟磷酸酯(HBTU)，N-羥基苯并三氮唑(HOBt)和4-二甲氨基哌啶(DMAP)，之后加入N-甲基嗎啉(NMM)調(diào)pH=7～8，氮?dú)獯捣?，反?yīng)8 h。反應(yīng)畢，將反應(yīng)液抽干，然后用 DMF和二氯甲烷交替洗滌樹(shù)脂，抽干。

Fmoc-Pro-OH與2-Cl-Trt樹(shù)脂的連接采用上述相同的方法。

1.2.2 脫 Fmoc保護(hù)基

取體積分?jǐn)?shù)為20%的 PIP(哌啶)/DMF溶液，加入Fmoc保護(hù)的氨基酸樹(shù)脂中，緩慢攪拌40 min。脫除反應(yīng)結(jié)束后，將反應(yīng)液抽干，然后用DMF和DCM交替洗滌樹(shù)脂至干凈為止。

1.2.3 接肽反應(yīng)

取3倍量的保護(hù)氨基酸，HBTU和HOBt，加入固相反應(yīng)器中，加 DMF 溶劑和NMM調(diào)節(jié)pH=7～8，氮?dú)獯捣鳎肒aiser試劑監(jiān)測(cè)反應(yīng)進(jìn)程。反應(yīng)完成后，將反應(yīng)液抽干，并用 DMF和DCM交替洗滌樹(shù)脂。

1.2.4 四肽pGlu-His-Trp-Ser-OH 的合成

根據(jù)四肽的氨基酸序列，三倍量的Fmoc-Trp-OH、Fmoc-His(Trt)-OH和pGlu依次按照接肽反應(yīng)方法與Ser(But)-2-Cl-Trt樹(shù)脂進(jìn)行反應(yīng)，得到全保護(hù)四肽樹(shù)脂(pGlu-His(Trt)-Trp-Ser(But)-Resin)。洗滌干凈后向固相反應(yīng)器中加入比例為TFA:TIS:H2O=95:5.0:2.5的切割液反應(yīng)30 min，抽濾，濾液旋蒸得粘稠狀液體，傾入冰冷乙醚，有白色固體析出，固體經(jīng)高壓制備純化得四肽純品。

1.2.5 五肽Fmoc-Tyr(Bzl)-D-Ser(But)-Leu-Arg(NO2)-Pro-OH的合成

依據(jù)五肽的氨基酸序列，依次加入Fmoc-Arg(NO2)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-D-Ser(But)-OH、Fmoc-Tyr(Bzl)-OH至Pro-2-Cl-Trt樹(shù)脂體系進(jìn)行接肽反應(yīng)。接肽反應(yīng)完畢后洗滌，再用TFA/DCM=1%的切割液切割樹(shù)脂。旋蒸切割液，加入冷乙醚析出白色固體，收率為28.3%。

1.2.6 五肽Fmoc-Tyr(Bzl)-D-Ser(But)-Leu-Arg(NO2)-Pro-NHEt的合成

稱取Fmoc-5t 0.41 g(0.39 mmol)加入到25 mL圓底燒瓶中，加入DMF 10 mL，冰浴下加入DIEA，調(diào)pH約為8，向其中加入DCC(1.96 mmol)，HOBT(1.96 mmol)，攪拌溶解，反應(yīng) 5 min。準(zhǔn)確量取乙胺0.13 mL(2.0 mmol)加入反應(yīng)體系中，室溫?cái)嚢?，TLC監(jiān)測(cè)反應(yīng)進(jìn)程，待Fmoc-5t消失后，將溶劑蒸除，加入乙醇，有白色固體析出，抽濾，真空干燥，收率為80.2%。

1.2.7 五肽Tyr(Bzl)-D-Ser(But)-Leu-Arg(NO2)-Pro-NHEt的合成

將Fmoc-Tyr(Bzl)-D-Ser(But)-Leu-Arg(NO2)-Pro-NHEt 0.26 g(0.25 mmol)置于圓底燒瓶中，加入PIP:DMF=20% 的溶液10 mL攪拌溶解，TLC監(jiān)測(cè)反應(yīng)。得0.18 g白色固體，收率91.3%。

1.2.8 五肽Tyr-D-Ser(But)-Leu-Arg-Pro-NHEt的合成

向裝有電磁攪拌的高壓反應(yīng)釜中加入Tyr(Bzl)-D-Ser(But)-Leu-Arg(NO2)-Pro-NHEt(4.8 g，5.0 mmol)，然后加入甲醇(100 mL)，攪拌至溶解，加入5% Pd/C(0.5 g)，氫氣置換空氣3次，于室溫和10 bar的壓力下反應(yīng)2.0 h，反應(yīng)畢。過(guò)濾，減壓蒸除溶劑，用高壓制備液相分離純化后得純品Tyr-D-Ser(But)-Leu-Arg-Pro-NHEt(2.5 g，收率75.4%)。

1.2.9 布舍瑞林pGlu-His-Trp-Ser-Tyr-D-Ser(But)-Leu-Arg-Pro-NHEt的合成

取pGlu-His-Trp-Ser-OH 8.3 g(15 mmol)，溶于50 mL DMF中，冰鹽浴下依次加入1.75 mL NMM，5.7 g HBTU和Tyr-D-Ser(But)-Leu-Arg-Pro-NH-Et 10.75 g(15 mmol)，補(bǔ)加NMM調(diào)節(jié)pH約為8，冰鹽浴攪拌40 min后轉(zhuǎn)至室溫繼續(xù)攪拌，高壓液相色譜監(jiān)測(cè)反應(yīng)程度。反應(yīng)畢，減壓蒸除溶劑，殘留物用甲醇-乙酸乙酯重結(jié)晶得白色固體粗品13.8 g。

1.2.10 布舍瑞林的高壓制備液相分離純化及凍干

用乙腈/水(20/80)溶液溶解粗品，濃度為1.0 g/mL，用TFA調(diào)整溶液pH值3.0左右。使用直徑=300 mm、孔徑=0.45 μm 微孔濾膜過(guò)濾待用。制備柱：15 cm×30 cm柱，kromasil 10 μm C18反相色譜填料顆粒。流動(dòng)相A：0.1% TFA水溶液；流動(dòng)相B：90%乙腈/10%水/0.1%TFA，梯度洗脫，收集主峰組份。旋轉(zhuǎn)蒸除有機(jī)溶劑后，凍干得布舍瑞林純品，純度達(dá)98%。

2 結(jié)果與討論

2.1 產(chǎn)物表征

采用上述合成路線所得布舍瑞林，質(zhì)譜圖中主峰顯示的分子質(zhì)量為1240.1 ku(M+H)+(圖3)，與理論分子質(zhì)量1038.66 ku基本吻合。經(jīng)HPLC純度分析，其純度可達(dá)97%。主峰的保留時(shí)間與對(duì)照品完全一致，結(jié)合質(zhì)譜結(jié)果，說(shuō)明產(chǎn)物為布舍瑞林。

圖3 布舍瑞林的質(zhì)譜結(jié)果

圖4 布舍瑞林的HPLC色譜圖

HPLC的色譜條件：4.6 mm×25 cm(C18)；流動(dòng)相A液：1 mL/L三氟乙酸/水溶液，B液：1 mL/L三氟乙酸/乙腈溶液。梯度洗脫：900 mL/L A液+100 mL/L B液在35 min內(nèi)降為100 mL/L A液+ 900 mL/L B液，檢測(cè)波長(zhǎng)：220 nm，流速：1 mL/min。

2.2 四肽pGlu-His-Trp-Ser-OH的固相合成

2.2.1 采用Fmoc-Trp-OH代替Fmoc-Trp(Boc)-OH可降低成本

表1 Fmoc-Trp-OH代替Fmoc-Trp(Boc)-OH的影響

比較了Fmoc-Trp(Boc)-OH和Fmoc-Trp-OH對(duì)四肽合成的影響，結(jié)果如表1所示。使用Fmoc-Trp-OH進(jìn)行四肽合成，對(duì)粗品純度和收率的影響不大，但Fmoc-Trp-OH的分子量更小且價(jià)格更為便宜，因此可大大降低四肽的合成成本。

2.2.2 切割劑的選擇

當(dāng)使用酸將肽鏈從樹(shù)脂上切除時(shí)，會(huì)產(chǎn)生碳正離子樹(shù)脂，同時(shí)一些側(cè)鏈保護(hù)基也會(huì)被酸解下來(lái)，產(chǎn)生側(cè)鏈保護(hù)基的碳正離子，如果這些碳正離子沒(méi)有及時(shí)被清除，就會(huì)被肽鏈中親核性強(qiáng)的基團(tuán)進(jìn)攻，形成副產(chǎn)物，因此，應(yīng)該加入清除劑將碳正離子捕獲。本實(shí)驗(yàn)對(duì)兩種清除劑乙二硫醇(EDT)和三異丙基硅烷(TIS)作用效果進(jìn)行了比較，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 切割試劑的選擇

將乙醚吹干后，以EDT為清除劑的產(chǎn)品，性狀為粘稠狀，高壓制備液相后產(chǎn)率為28.3%，以TIS為清除劑的產(chǎn)品，得到白色固體，經(jīng)高壓制備液相后產(chǎn)率為29.6%，兩者產(chǎn)率相差不大，但是由于EDT本身有惡臭的氣味，產(chǎn)物粘稠，因此最終選用TIS作為清除劑。

2.3 五肽Tyr-D-Ser(But)-Leu-Arg-Pro-NHEt的合成

2.3.1 樹(shù)脂的選擇

五肽的C末端氨基酸為Pro，其很容易產(chǎn)生哌嗪二酮，導(dǎo)致肽的產(chǎn)量降低。由于2-Cl-Trt樹(shù)脂2位Cl原子的空間位阻比較大，使其形成哌嗪二酮的幾率降低，因此本實(shí)驗(yàn)采用2-Cl-Trt樹(shù)脂為固相載體。

2.3.2 4+5片段縮合合成布舍瑞林

本文考察了兩種4+5片段縮合合成布舍瑞林的方法。方法1：四肽pGlu-His-Trp-Ser-OH與保護(hù)五肽Tyr(Bzl)-D-Ser(But)-Leu-Arg(NO2)-Pro-NHEt 在縮合劑作用下先生成保護(hù)九肽，再催化氫化脫除側(cè)鏈保護(hù)基得布舍瑞林；方法2：先脫除五肽的側(cè)鏈保護(hù)基得Tyr-D-Ser(But)-Leu-Arg-Pro-NHEt，然后與四肽反應(yīng)得到布舍瑞林。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，采用方法1反應(yīng)時(shí)間更長(zhǎng)，收率低且產(chǎn)物復(fù)雜，很難純化。因此選擇方法2進(jìn)行布舍瑞林的合成。

3 結(jié) 論

通過(guò)液相-固相結(jié)合的方法合成布舍瑞林，既簡(jiǎn)化了純液相合成的繁瑣，縮短了反應(yīng)時(shí)間，又避免了純固相合成中間過(guò)程難以控制，副產(chǎn)物多難以純化的缺點(diǎn)。