孟峰 張亞玲 靳學(xué)慧

黑龍江省稻瘟病菌無毒基因及其同源基因的檢測與分析

孟峰 張亞玲*靳學(xué)慧

(黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué), 黑龍江 大慶 163319; *通信聯(lián)系人, E-mail: byndzyl@163.com)

【】為了檢測黑龍江省稻瘟病菌無毒基因及其同源基因分布情況與變異機(jī)制，了解其變異類型的致病表型。采用3個無毒基因、和的特異性引物，對202個采自黑龍江省各稻區(qū)的稻瘟病菌單孢分離菌株的DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，通過瓊脂糖凝膠電泳檢測分析，挑選不同帶型和不同地區(qū)代表菌株的PCR產(chǎn)物進(jìn)行測序。測序結(jié)果與相應(yīng)無毒基因序列進(jìn)行堿基與氨基酸序列的比較分析，并利用水稻抗性單基因系，對不同變異類型的稻瘟病菌株進(jìn)行功能驗證。的出現(xiàn)頻率為36.14％，出現(xiàn)頻率為59.41％。在黑龍江省202個菌株DNA中未擴(kuò)增出目的條帶。對和的部分PCR產(chǎn)物進(jìn)行序列分析，檢測出有5種變異類型，它們是、、、和。經(jīng)功能驗證，、、和無毒功能喪失。而無毒基因未檢測出變異菌株。變異能力較強(qiáng)，導(dǎo)致大多數(shù)菌株無毒功能喪失，需與其他抗性基因搭配使用。在黑龍江省稻瘟病菌生理小種中未發(fā)現(xiàn)基因。基因序列在菌株中比較穩(wěn)定。

稻瘟病菌；及其同源基因；功能驗證

稻瘟病是由稻瘟病菌引起的，是世界上最重要的水稻病害之一，嚴(yán)重威脅水稻高產(chǎn)穩(wěn)產(chǎn)，每年因該病害引起的水稻產(chǎn)量損失高達(dá)10％~30％，嚴(yán)重時顆粒無收[1]。實踐證明，利用品種抗性是防治稻瘟病最經(jīng)濟(jì)、安全、有效的途徑。目前定位到的稻瘟病主效抗性基因已達(dá)100多個，其中，已克隆的有36個[2]。稻瘟病菌與水稻之間的互作符合經(jīng)典的基因?qū)驅(qū)W說，即致病菌中的無毒()基因在功能上與水稻中的特定抗病基因()相對應(yīng)。水稻品種的抗性基因與稻瘟病菌的無毒基因相互作用時，表現(xiàn)出抗瘟性[3-4]。目前已報道的無毒基因有70多個，其中，12個被克隆，包括、和等[5-14]。Orbach等[7]成功克隆了稻瘟病菌無毒基因。與水稻抗性基因互作的無毒基因是一個編碼含223個氨基酸的分泌蛋白，含有保守的金屬蛋白酶結(jié)構(gòu)域，是首個被證實編碼蛋白能與相對應(yīng)的抗病基因產(chǎn)物直接互作的無毒基因。Khang等[15]發(fā)現(xiàn)了的兩個新同源體，命名為和，并將重新命名為。甘玉姿等[16]在菲律賓稻瘟病菌生理小種中發(fā)現(xiàn)了的新同源序列，將其命名為。其中無毒基因和基因是有功能的，與抗性基因相互作用，而和不具有無毒功能[16,17]。劉殿宇等[18]研究發(fā)現(xiàn)2014年和2015年黑龍江省出現(xiàn)頻率分別為23.0%和22.9%；李思博等[19]在2014和2015年遼寧省檢測到的出現(xiàn)頻率為89.91%和76.00%；朱名海等[20]在南繁區(qū)檢測到的出現(xiàn)頻率為93.33%。

本研究結(jié)合無毒基因家族的基因擴(kuò)增、測序結(jié)果和變異類型的功能驗證，對采集自黑龍江省不同稻區(qū)的稻瘟病菌進(jìn)行分析，從而明確黑龍江省稻瘟病菌基因家族的分布情況及變異類型，以期為黑龍江省抗瘟品種的合理布局與稻瘟病的有效防控提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試菌株

2017年在黑龍江省7個市15個縣水稻種植區(qū)內(nèi)采集水稻穗頸瘟標(biāo)樣，經(jīng)分離獲得單孢菌株202個，采用濾紙片保存法[21]保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 供試材料

供試水稻品種為國際水稻研究所選育的含有基因的麗江新團(tuán)黑谷抗稻瘟病近等基因系IRBtLa-kl，感病對照為麗江新團(tuán)黑谷。

1.3 稻瘟病菌基因組DNA提取

將分離純化的稻瘟病菌單孢菌株在PDA固體培養(yǎng)基上活化培養(yǎng)，挑取適量菌絲塊接到酵母液體培養(yǎng)基中，于28℃、120 r/min搖床振蕩培養(yǎng)3~5 d,收集菌絲體，分裝于1.5 mL離心管中，–20℃下保存?zhèn)溆?。使用真菌DNA提取試劑盒(D3390-01 OmegaBio-Tek公司)提取稻瘟病菌基因組DNA，用微量分光光度計測定DNA濃度，并將DNA原液稀釋成60 ng/μL的工作液備用。原液–20℃下保存。

1.4 引物設(shè)計

根據(jù)文獻(xiàn)中已克隆的于NCBI上查找其基因序列，利用Primer Premier 5.0設(shè)計一對特異性引物，和的特異性引物參照甘玉姿等[16]序列。所有引物均委托上海生工生物工程技術(shù)有限公司合成，引物序列見表1。

1.5 PCR擴(kuò)增及測序分析

PCR體系(20 μL)包括r酶0.1 μL，10×緩沖液(Mg+) 2.0 μL，dNTP混合液1.6 μL，正反向引物各0.3 μL，DNA模板 1 μL，加dd H2O補(bǔ)足20 μL。擴(kuò)增程序：94℃下預(yù)變性4 min；94℃下變性45 s，55℃下退火45 s，72℃下延伸60 s，30個循環(huán)；72℃下延伸10 min。擴(kuò)增產(chǎn)物在1%的瓊脂糖凝膠中電泳檢測并在凝膠電泳成像系統(tǒng)下觀察并拍照，統(tǒng)計無毒基因擴(kuò)增頻率。

從202個稻瘟病菌菌株中挑選帶型不同和不同地區(qū)來源的部分菌株送上海生工生物工程技術(shù)有限公司測序，測序結(jié)果采用Lasergene 7.0的Seq Man軟件進(jìn)行比對與拼接；并采用DNAMAN軟件對有差異的核苷酸序列進(jìn)行比較分析。

表1 用于擴(kuò)增稻瘟病菌無毒基因AVR-Pita的引物

1.6 水稻稻瘟病接種與調(diào)查

水稻3葉1心時，用無菌水洗下孢子，雙層紗布過濾，調(diào)節(jié)孢子量為1×105個/mL，將5 mL菌懸液加入5 mL明膠溶液搖勻后噴灑秧苗，25℃下遮光保濕培養(yǎng)24 h后自然條件下培養(yǎng)，接種后5 d調(diào)查稻瘟病發(fā)病情況，調(diào)查標(biāo)準(zhǔn)參照文獻(xiàn)[22]。

2 結(jié)果與分析

2.1 AVR-Pita及其同源基因PCR產(chǎn)物擴(kuò)增檢測

以202個稻瘟病菌菌株的DNA為模板，根據(jù)無毒基因及其同源基因序列設(shè)計的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增(圖1)，電泳結(jié)果顯示共有5種帶型：無帶、高帶(正常帶型)、低帶、雙帶和三帶。雙帶為非目的條帶[23]，三帶為多位點現(xiàn)象。引物在供試的202個菌株中，73個菌株能擴(kuò)增出目的條帶，出現(xiàn)頻率為36.1％(表2)，其中大慶杜蒙、肇源，哈爾濱方正、尚志出現(xiàn)頻率為0%(表2)；引物在所有供試菌株DNA中均未擴(kuò)增出目的條帶；引物電泳結(jié)果顯示120個菌株DNA中擴(kuò)增出目的條帶，出現(xiàn)頻率為59.4％。供試202個菌株中54個菌株DNA同時擴(kuò)增出和。

A?AVR-Pita1的部分?jǐn)U增結(jié)果; B?AVR-Pita3的部分?jǐn)U增結(jié)果。M1?分子標(biāo)記DL2000；+：存在；-：缺失；1：低帶；2：雙帶；3：三帶。

Fig. 1. PCR detection ofand its homologous genesamplification to the tested strains.

表2 2017年黑龍江省稻瘟病菌無毒基因AVR-Pita1及其同源基因分布情況

2.2 AVR-Pita及其同源基因的序列分析

2.2.1 無毒基因的序列分析

從73個擴(kuò)增出目的條帶的菌株中挑選不同地區(qū)不同帶型的菌株20個進(jìn)行測序。將測序得到的基因序列與參考序列(AF207841.1)比對。結(jié)果顯示(圖2)，20個菌株的無毒基因菌株序列可分為5類，一類為存在基因序列1250 bp的缺失,從基因上游1004 bp至下游246 bp處。此變異類型與余歡等[24]研究結(jié)果一致，我們將其命名為。其余四類為單堿基的替換、缺失與插入(圖2),我們分別將其命名為和。與Dai等[25]報道的結(jié)果序列一致。

的4類堿基序列所翻譯氨基酸序列與已克隆的氨基酸序列比對結(jié)果見圖3，除312(T/G)為同義突變外，其余堿基的突變均會導(dǎo)致氨基酸的錯義翻譯。氨基酸序列不僅在6L(Insert)、88(R/K)和104(K/N)存在錯義突變，而且在174位處發(fā)生移碼突變導(dǎo)致后面氨基酸發(fā)生變化。氨基酸序列存在8處錯義突變：6L(Insert)、82(N/S)、83(D/N)、88(R/K)、104(K/N)、136(G/E)、174(V/I)和192(Y/C)，的氨基酸序列存在7處錯義突變：6 L(Insert)、82(N/S)、83(D/N)、88(R/K)、104(K/N)、174(V/I)和192(Y/C)。的氨基酸序列不同于其他4類，它與氨基酸序列比對一致性為25.45％(圖4)，氨基酸的缺失與錯義翻譯較多，將進(jìn)行單獨分析。

20個測序的菌株中，包含2個菌株，占測序菌株的1/10；包含4個菌株，占測序菌株的1/5；類型較多，包含10個菌株，占測序菌株的1/2；包含3個菌株，占測序菌株的3/20；包含1個菌株，占測序總菌株的1/20(圖5)。

2.2.2 無毒基因的序列分析

從120個含有目的條帶的菌株中挑選不同地區(qū)的菌株20個進(jìn)行測序，將測序得到的基因序列與已克隆的基因序列比對后發(fā)現(xiàn)，20個菌株的基因序列比對結(jié)果完全一致。說明在這20個菌株中沒有出現(xiàn)變異情況。

2.3 AVR-Pita1致病表型分析

對無毒基因型的5種突變類型進(jìn)行功能驗證，如圖6所示，以麗江新團(tuán)黑谷(LTH)為對照。結(jié)果顯示，、-、和不能被識別表現(xiàn)有毒性，無毒功能喪失。C可以被識別而表現(xiàn)為無毒性。

3 討論

了解家族成員在稻瘟病菌中的分布與變異情況，不僅對研究稻瘟病菌的遺傳多樣性具有重要價值而且可為抗病品種的布局及病情的分子預(yù)警提供參考依據(jù)。2017年，從黑龍江省各稻區(qū)水稻穗頸瘟標(biāo)樣中分離獲得單孢菌株202個，利用202個單孢菌株對及其同源基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)出現(xiàn)頻率最高，為59.41％，且分布范圍最廣，各稻區(qū)均有分布。出現(xiàn)頻率為36.14％，其中，大慶杜蒙、肇源，哈爾濱方正、尚志出現(xiàn)頻率為0。在54個菌株的DNA中同時擴(kuò)增出和，與序列之間存在71％~72％一致性，驗證了這2個基因可能起源于同一個原始基因的復(fù)制事件。在供試202個菌株的DNA中均未擴(kuò)增出目的條帶，與甘玉姿等[16]對菲律賓稻瘟病菌生理小種研究結(jié)果一致。本研究未檢測出目的基因，推測2017年黑龍江省稻瘟病菌生理小種中可能不含或含有少量基因。本研究由于田間分離的菌株已經(jīng)經(jīng)過了水稻品種的篩選，不能代表實際的田間群體，所以不能很好地反映田間實際菌株無毒基因的分布情況。

圖2 稻瘟病菌供試菌株AVR-Pita1-A、AVR-Pita1-B、AVR-Pita1-C和AVR-Pita1-D堿基序列比對

Fig. 2. Base sequence comparison ofandof the tested strains.

圖3 稻瘟病菌和氨基酸序列對比分析

Fig. 3. Comparison and analysis of amino acid sequence ofandgenotypes

圖4 稻瘟病菌AVR-Pita1-D 氨基酸序列對比分析

Fig. 4. Comparison and analysis of amino acid sequence ofgenotypes of

圖5 稻瘟病菌變異類型比例

Fig. 5. Proportion ofvariant types

圖6 稻瘟病菌供試菌株AVR-Pita1-1、AVR-Pita1-A、AVR-Pita1-B、AVR-Pita1-C和AVR-Pita1-D致病癥狀

Fig. 6. Symptoms after infected by the strains with,,and

研究者們認(rèn)為，導(dǎo)致無毒基因不穩(wěn)定的重要因素為所處的周邊基因環(huán)境，和均處于染色體的亞端粒區(qū)[15]，并且在稻瘟病菌1、3、4、5、6、7等染色體上均有發(fā)現(xiàn)[26]，具有高度可變性。存在插入、缺失與點突變等多種變異類型。Dai等[25]檢測到27種突變類型，Zhou等[23]在毒性菌株B2中發(fā)現(xiàn)了完整的轉(zhuǎn)座子Pot3，但在黑龍江省202個菌株的DNA中未檢測到Pot3。與和不同，大多數(shù)菌株的以比較穩(wěn)定的形式存在于稻瘟病菌基因組第7染色體上，本研究測序的20個菌株中均未發(fā)現(xiàn)變異情況，與前人研究結(jié)果相符。

本研究發(fā)現(xiàn)存在5種變異類型，其中4種無毒功能喪失，僅可以被識別而表現(xiàn)為無毒性。但-C類型僅占測序菌株數(shù)的3/20，大多數(shù)菌株已喪失無毒功能。于連鵬[27]在黑龍江省48個水稻品種中檢測到35個品種含有基因，占供試水稻品種的72.92％。周江鴻等[28]報道，在我國稻瘟病菌群體中抗性基因表現(xiàn)為中等至強(qiáng)毒力水平。所以在黑龍江省稻瘟病的抗病育種中不宜單獨使用，需要與含有其他抗性基因的品種搭配使用，才能達(dá)到抗病效果。變異能力較強(qiáng)，應(yīng)同時加強(qiáng)對的田間監(jiān)測，及時了解的變化規(guī)律，以有效地控制病害發(fā)生。

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Detection and Analysis ofAvirulent Geneand Its Homologous Genes in Heilongjiang Province

MENG Feng, ZHANG Yaling*, JIN Xuehui

(Heilongjiang Bayi Agricultural University, Daqing 163319, China;*Corresponding author, E-mail: byndzyl@163.com)

【】We aimto investigate the distribution and variation of avirulentfamily offrom Heilongjiang Province, and to understand the pathogenic phenotypes ofavirulencealleles.【】Specific primers of the three avirulent genes,andwere used. 202single-spore isolates were obtained from different regions of Heilongjiang Province, their DNA were PCR-amplified by using avirulent genes primers in 2017. PCR products of representative strains falling into different types and from different aresa were selected and sequenced by using agarose gel electrophoresis detection. The base and amino acid sequences were compared with those of the corresponding avirulent genes, and the rice resistant single gene line was used to verify the function of different strains of.【】The frequency ofis 36.14%, and that ofis 59.41%. The target band ofcould not be amplified from the DNA of202 strains from Heilongjiang Province. Sequence analysis of some PCR products ofandwere carried out. Five variation types ofwere detected; they were-,-,,and. Functional verification showed that,,and-lost their function. No mutant strain was detected in the virulent gene. 【】had strong mutation ability, which led to the loss of avirulent function of most strains, this should be used in conjunction with other resistant genes.was not found inHeilongjiang Province. The sequence ofgene was stable in the strain.

;gene family; functional verification

S435.111.4+1

A

1001-7216(2020)02-0143-07

10.16819/j.1001-7216.2020.9085

2019-07-21;

2019-11-21。

黑龍江省自然科學(xué)基金資助項目(QC2011C046)；黑龍江省農(nóng)墾總局科技攻關(guān)計劃資助項目(HNK125A-08-06, HNKXIV-01-04-02, HKKYZD190205)；黑龍江省教育廳項目(12521376)；黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)學(xué)成、引進(jìn)人才科研啟動計劃資助項目(XDB201605, XDB201802)。