王昌健 陳龍 代麗萍 路雪麗 賀金立 楊龍 胡江 朱麗 董國(guó)軍 張光恒 高振宇 任德勇 陳光 沈蘭 張強(qiáng) 郭龍彪 錢前 曾大力

水稻花器官發(fā)育基因的鑒定和精細(xì)定位

王昌健#陳龍#代麗萍 路雪麗 賀金立 楊龍 胡江 朱麗 董國(guó)軍 張光恒 高振宇 任德勇 陳光 沈蘭 張強(qiáng) 郭龍彪 錢前*曾大力*

(中國(guó)水稻研究所 水稻生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 杭州 310006；#共同第一作者;*通信聯(lián)系人, E-mail: qianqian188@hotmail.com; dalizeng@126.com)

【】鑒定和克隆花器官發(fā)育相關(guān)基因，為進(jìn)一步研究水稻花發(fā)育的分子機(jī)制奠定基礎(chǔ)。在大田常規(guī)種植條件下比較了突變體()和野生型春江06的主要農(nóng)藝性狀及花器官形態(tài)特征差異；掃描電鏡及石蠟切片觀察花藥結(jié)構(gòu)并用染色法觀察花粉和胚囊的育性；利用圖位克隆方法進(jìn)行基因精細(xì)定位；qRT-PCR分析了花發(fā)育相關(guān)基因在野生型和突變體中的表達(dá)水平。突變體抽穗期變長(zhǎng)，不能正常揚(yáng)花，雄蕊和雌蕊皺縮且花藥和柱頭數(shù)目增多；進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，突變體花藥腔室塌陷，內(nèi)無可見小孢子，即使部分花藥形成腔室，花粉粒也無淀粉積累呈干癟狀。此外，突變體胚囊育性也受到影響；遺傳分析表明該突變性狀受一對(duì)隱性核基因控制，該基因位于第4染色體短臂上91.2 kb的區(qū)間內(nèi)，區(qū)間內(nèi)未見花器官發(fā)育相關(guān)基因的報(bào)道。qRT-PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，水稻ABCDE模型中的B類、C類和E類基因的表達(dá)在突變體中顯著升高。突變體的雄蕊及雌蕊均發(fā)育異常，最終導(dǎo)致完全不育，推測(cè)可能在水稻第3輪雄蕊發(fā)育和第4輪雌蕊發(fā)育調(diào)控中發(fā)揮重要作用。

水稻；；花器官發(fā)育；基因定位

水稻是重要的糧食作物之一，也是單子葉模式植物，其花器官的形成發(fā)育直接影響水稻產(chǎn)量。因此，對(duì)水稻花器官發(fā)育相關(guān)基因的克隆和功能分析不僅有助于進(jìn)一步認(rèn)識(shí)水稻花發(fā)育的調(diào)控機(jī)理，也具有重要的實(shí)踐意義。20世紀(jì)90年代初期，學(xué)者們通過對(duì)金魚草()和雙子葉模式植物擬南芥()大量花器官突變體的研究，提出了經(jīng)典的花器官發(fā)育ABC模型[1, 2]。在ABC模型中，A、B、C三類基因單獨(dú)或協(xié)同調(diào)控萼片、花瓣、雄蕊和雌蕊四輪花器官發(fā)育。其中，A類基因()和()單獨(dú)調(diào)控萼片發(fā)育；A類和B類基因()和()協(xié)同調(diào)控花瓣的發(fā)育；B類和C類基因()協(xié)同調(diào)控雄蕊發(fā)育；C類基因單獨(dú)調(diào)控心皮發(fā)育[3]。隨著研究的深入，ABC模型進(jìn)一步完善并發(fā)展成ABCDE模型，其中，D類基因()與C類基因互為冗余地調(diào)控胚珠發(fā)育；而E類()基因參與調(diào)控所有花器官的發(fā)育[3, 4]。

研究表明雙子葉植物的ABCDE模型也部分適用于單子葉植物。對(duì)于模式植物水稻而言，其小穗由2枚護(hù)穎、2朵退化的不育花和1朵可育花構(gòu)成；可育花由外到內(nèi)依次由1枚外稃、1枚內(nèi)稃、2枚漿片、6枚雄蕊和1枚雌蕊共四輪花器官構(gòu)成。與雙子葉植物相比，水稻B類、C類基因和D類基因在功能上具有一定保守性，但也有部分基因發(fā)生了復(fù)制和功能分化。在水稻B類基因中，的RNA干涉株系中，其漿片變大，但不影響雄蕊發(fā)育[5-6]；主要在花粉、絨氈層及柱頭中表達(dá)，其RNA干涉株系表現(xiàn)為漿片變成內(nèi)稃和外稃狀結(jié)構(gòu)，雄蕊變成心皮狀結(jié)構(gòu)，說明主要調(diào)控水稻漿片和雄蕊的發(fā)育[7]；（）主要在漿片和雄蕊中表達(dá)，在雌蕊中也能檢測(cè)到表達(dá)，該基因突變導(dǎo)致漿片向內(nèi)稃狀結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)變，雄蕊向心皮結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)變[8]，研究表明與、協(xié)同調(diào)控花器官的形態(tài)[9]，可能通過介導(dǎo)的調(diào)控途徑來參與水稻第2輪漿片和第3輪雄蕊發(fā)育[10]。目前在水稻中發(fā)現(xiàn)2個(gè)C類基因，分別是和，二者都是擬南芥同源基因；其中，只在雄蕊、雌蕊和胚珠原基中表達(dá)，該基因突變導(dǎo)致雄蕊向漿片轉(zhuǎn)變，形成異位漿片，但心皮發(fā)育正常[11-12]。在的RNA干涉株系中，其花器官由重復(fù)的漿片、雄蕊和心皮狀組織構(gòu)成，說明主要參與調(diào)控花分生組織的決定和心皮的發(fā)育[12]。水稻中存在2個(gè)D類同源基因，即和。主要在胚珠中表達(dá)，特異調(diào)控胚珠的發(fā)育，該基因突變導(dǎo)致雌性不育[13-14]；主要在發(fā)育的種子中表達(dá)，在胚珠中不表達(dá)，突變后其胚珠發(fā)育正常，說明可能不參與胚珠的發(fā)育調(diào)控[14]。此外，水稻中可能的E類基因有、、、、和。突變導(dǎo)致小穗內(nèi)、外稃呈葉狀，漿片伸長(zhǎng)，雄蕊數(shù)目減少，心皮數(shù)目增加[15]。突變后小穗內(nèi)稃結(jié)構(gòu)和心皮發(fā)育異常，花分生組織特征缺失。和雙突變體植株的突變表型更加嚴(yán)重，二者協(xié)同調(diào)控水稻花器官形態(tài)[16]。另外，和都可以與互作，這兩個(gè)基因在花分生組織、雄蕊和雌蕊中都有表達(dá)，在功能上具有冗余性，突變后雄蕊數(shù)目增加，心皮發(fā)育異常[17]。

除了用ABCDE模型來解釋花器官發(fā)育的機(jī)制外，有研究表明其它基因也能影響花器官的發(fā)育，如花器官發(fā)育過程中參與調(diào)控花器官數(shù)目的基因()，包括[18]、[19]、[20]、[21]和[22]，在水稻中這些基因的突變導(dǎo)致雄蕊或雌蕊數(shù)目不同程度的增加。而且，這5類基因的上游或下游調(diào)控因子也在花器官發(fā)育過程中發(fā)揮著重要的作用[23]。研究并克隆這類基因?qū)⒂兄陉U明水稻花器官發(fā)育的分子機(jī)理，為提高水稻產(chǎn)量、品質(zhì)和挖掘水稻潛在的種質(zhì)資源奠定基礎(chǔ)。

本實(shí)驗(yàn)室從春江06和TN1構(gòu)建的代換系中獲得了一個(gè)能穩(wěn)定遺傳的、花器官發(fā)育異常并完全不育的突變體。該突變體表現(xiàn)為小穗雄蕊和雌蕊結(jié)構(gòu)發(fā)育異常，且部分小穗的花藥和柱頭數(shù)目增加。為明確導(dǎo)致突變體表型特征和花器官發(fā)育異常的分子機(jī)制，我們對(duì)突變體進(jìn)行了形態(tài)學(xué)觀察和組織學(xué)分析；通過圖位克隆的策略精細(xì)定位了水稻基因；結(jié)合實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析了花器官發(fā)育相關(guān)基因在野生型和突變體中的表達(dá)差異。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

在春江06和TN1的代換系中發(fā)現(xiàn)一個(gè)能穩(wěn)定遺傳的不育株系，將該突變體命名為。由于突變體完全不育，以雜合體形式保存種質(zhì)資源。供試材料種植于中國(guó)水稻研究所杭州富陽和海南陵水實(shí)驗(yàn)基地。

1.2 植株和穎花形態(tài)觀察、花粉育性鑒定

抽穗期開始在田間觀察鑒定并標(biāo)記不育植株，取突變體及其野生型的成熟小穗，在解剖鏡下觀察花器官形態(tài)和數(shù)目并做統(tǒng)計(jì)。在當(dāng)日開花前，取突變體和野生型的穎花，每株3個(gè)重復(fù)，體視鏡下剝離花藥，1% I2-KI染色鏡檢，拍照并統(tǒng)計(jì)花粉敗育數(shù)目。

1.3 愛氏蘇木精染色法觀察胚囊育性

在水稻胚囊成熟期取植株小穗，F(xiàn)AA固定液固定24 h后，用50%乙醇沖洗2次，體式鏡下分離出子房，并以梯度酒精（50%、30%）和蒸餾水復(fù)水，然后用2%的硫酸鋁鉀染色20 min，愛氏蘇木精染液染色30 min，水洗3次，梯度酒精（30%、50%、70%、80%、90%、無水乙醇）脫水。用無水乙醇和水楊酸甲酯等體積混合液浸泡4 h，水楊酸甲酯透明20 h，最后將子房置于載玻片上，并用LEICA熒光顯微鏡觀察、拍照。

1.4 花藥和花粉粒的掃描電鏡觀察

用尖頭鑷子剝出野生型和突變體花藥，立刻置于2.5%戊二醛固定液中,使用真空抽氣泵抽真空使材料沉到固定液底部，室溫下固定2 h，4℃下固定24 h。0.2 mol/L磷酸緩沖液(pH=7.0)漂洗3次，依次經(jīng)過30%、50%、70%、80%、90%的梯度酒精脫水各10 min，無水乙醇脫水兩次，每次20 min。于乙酸異戊酯中置換25分鐘后CO2臨界點(diǎn)干燥，真空鍍膜后在掃描電鏡上選用不同倍數(shù)觀察、拍照。

1.5 花藥的石蠟切片觀察

取野生型和突變體幼穗和成熟小穗，立即置于FAA固定液中4℃下固定24 h，5%氫氟酸軟化7 d，經(jīng)乙醇梯度脫水、二甲苯透明、浸蠟、包埋、脫蠟、切片（厚度為10 μm），1%番紅和1%固綠染色，梯度乙醇復(fù)水，中性樹脂封片后，在LEICA熒光顯微鏡下觀察和拍照。

1.6 遺傳分析和定位群體構(gòu)建

用雜合體分別與日本晴和9311配制雜交組合，雜交獲得F1種子并分單株全部收種，將F1種子按單株播種，每株系種約100株，構(gòu)成數(shù)個(gè)小F2群體。于成熟期調(diào)查每個(gè)小群體，觀察并統(tǒng)計(jì)是否出現(xiàn)育性分離，把育性分離株系的F1種子全部播種得到大的F2群體，觀察并分別統(tǒng)計(jì)F2分離群體中正常表型個(gè)數(shù)和表型個(gè)數(shù)，計(jì)算分離比。所有實(shí)驗(yàn)材料于2018年及2019年種植在中國(guó)水稻研究所杭州試驗(yàn)基地和海南陵水試驗(yàn)基地。用雜合體和日本晴雜交產(chǎn)生的能分離的F2株系作為定位群體，從F2群體中選取成熟期表現(xiàn)不育性狀的單株（共2353個(gè)）進(jìn)行基因定位。

1.7 DPS2的基因定位

利用本實(shí)驗(yàn)室保存的250對(duì)均勻分布于12條染色體上的InDel標(biāo)記，根據(jù)混合分析法，對(duì)野生型、突變體、F1及混池（30個(gè)突變體表型單株等量混合）進(jìn)行基因型鑒定及連鎖分析。參考初定位區(qū)間內(nèi)日本晴和CJ06的全基因組序列，用Primer premier 3.0 在線網(wǎng)站設(shè)計(jì)新的InDel和dCAPS標(biāo)記進(jìn)行精細(xì)定位（表1），PCR產(chǎn)物用4%瓊脂糖凝膠電泳和8%聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測(cè)。

1.8 花器官發(fā)育相關(guān)基因的表達(dá)分析

用AXYGEN公司的植物RNA小量提取試劑盒，按照說明書步驟分別提取野生型和突變體0.5 ~1 cm幼穗的總RNA。反轉(zhuǎn)錄使用TOYOBO公司的ReverTra Ace quantitative PCR RT Master Mix試劑盒，步驟參照試劑盒說明書。qPCR體系(20 μL)為包括cDNA 2 μL，正、反向引物（10 μmol/L）各1 μL，SYBR qPCR Mix 10 μL，蒸餾水6 μL。反應(yīng)在Bio-Rad PCR儀上進(jìn)行，反應(yīng)程序如下：95℃下4 min，95℃下30 s，60℃下1 min，40個(gè)循環(huán)，12℃下保存。水稻(LOC_Os01g22493)基因作為內(nèi)參，正向引物序列為5′-CTCGCCGACTACAACAT CCA-3′，反向引物序列為5′-TCTTGGGCTTGGTGT ACGTCTT-3′。每個(gè)樣品設(shè)3次重復(fù)，采用2-法分析基因相對(duì)表達(dá)量[24]。

表1 部分實(shí)驗(yàn)引物

2 結(jié)果與分析

2.1 dps2突變體的表型鑒定

突變體在營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)期與野生型春江06相比在植株形態(tài)上沒有明顯差異(圖1-A、B)，但其抽穗期比野生型晚約5.5 d(圖1-E)，野生型開花時(shí)突變體未能正常開花(圖1-C~D)。在成熟期，野生型春江06能正常灌漿結(jié)實(shí)，而突變體小穗穎殼顏色逐漸變黃但無籽粒形成(圖1-F~I)，自然結(jié)實(shí)率為0%，顯著低于春江06(92.7%，圖1-J)。

2.2 dps2突變體雄蕊發(fā)育異常

觀察野生型和突變體的成熟穎花，發(fā)現(xiàn)野生型小穗花藥數(shù)目為正常的6枚，花藥飽滿呈黃色，花絲正常伸長(zhǎng)(圖2-A)，而突變體的6枚花藥全部皺縮(圖2-B)或表現(xiàn)出不同程度的皺縮(圖2-C)，花藥透明呈淺黃色，約10%突變體小穗花藥數(shù)目增多，多至7~12枚(圖2-D)。利用掃描電鏡觀察野生型和成熟花藥及其外壁，發(fā)現(xiàn)野生型花藥具有4個(gè)花藥室，表皮細(xì)胞均勻分布且結(jié)構(gòu)規(guī)則（圖2-E），而花藥短小皺縮，花藥腔室發(fā)育不完整，表皮細(xì)胞褶皺(圖2-F)，野生型花藥外壁表面飽滿并由線狀物質(zhì)構(gòu)成(圖2-G)，而突變體外表面光滑且沒有蠟質(zhì)和角質(zhì)等線狀物質(zhì)分布(圖2-H)。進(jìn)一步用碘染法觀察野生型和突變體的花粉活性，結(jié)果顯示，野生型98%的花粉粒能被染成深色，育性正常(圖2-I)，而突變體以典敗型花粉為主，只有約5%的花粉能正常染色(圖2-J)。

A, B?抽穗期植株; C, D?抽穗期穗部表型; E?在海南陵水和浙江杭州的抽穗期; F, G?成熟期植株; H, I?成熟期穗部表型, J?在海南陵水和浙江杭州的結(jié)實(shí)率。誤差線表示3次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的標(biāo)準(zhǔn)差。*和**分別表示野生型與突變體間差異達(dá)0.05和0.01顯著水平（t檢驗(yàn)）。在A, B, F, G圖中，標(biāo)尺為10 cm; C, D, H, I標(biāo)尺為2 cm。CJ06?春江06。

Fig. 1. Phenotypic comparison ofmutant and wild type CJ06 at heading and maturity stage.

A?野生型去除內(nèi)外稃的穎花; B~D?突變體dps2去除內(nèi)外稃的穎花; E?野生型花藥; F?dps2花藥; G?野生型花藥外壁; H?dps2花藥外壁; I?野生型花粉鏡檢; J?dps2花粉鏡檢。lo?漿片; An?花藥; F?花絲。A~D圖中標(biāo)尺為1 mm, E, F標(biāo)尺為100 μm, G, H標(biāo)尺為10 μm, I, J標(biāo)尺為50 μm。

Fig. 2. Stamens phenotypic observation of wild type Chunjiang 06(CJ06) andmutant.

A到C為野生型; D到I為突變體dps2。A, D和G?花藥發(fā)育第9時(shí)期花藥橫切面; B, E和H?第10時(shí)期花藥橫切面; C, F和I?第12時(shí)期花藥橫切面。Ep?表皮層; En?內(nèi)皮層; T?絨氈層; DT?退化絨氈層; Ms?小孢子母細(xì)胞; Msp?小孢子; Mp?成熟花粉。標(biāo)尺為10 μm。

Fig. 3. Transverse section of anthers ofmutant and wild type Chunjiang 06(CJ06) at different stages.

2.3 dps2突變體花藥及花粉的發(fā)育過程

通過花藥橫切來比較野生型和突變體花藥及花粉粒發(fā)育過程。張大兵等[25]將花藥發(fā)育過程分為14個(gè)時(shí)期。結(jié)果表明，在花藥發(fā)育第9時(shí)期，野生型藥室飽滿呈圓形，小孢子正常被釋放到藥室中，絨氈層濃縮，中間層完全消失（圖3-A）；而在相同時(shí)期的突變體花藥中，藥室發(fā)育成橢圓形，絨氈層不規(guī)則分散且包裹了小孢子（圖3-D）。在第10時(shí)期，野生型小孢子液泡化成圓形，絨氈層細(xì)胞基本降解呈帶狀（圖3-B），而突變體花藥空腔進(jìn)一步縮小，內(nèi)部無可見小孢子（圖3-E）。第12時(shí)期，野生型的花粉粒發(fā)育成熟，絨氈層完全消失（圖3-C），而突變體花藥室完全塌陷（圖3-F）。此外，我們觀察到未完全皺縮的花藥在第9時(shí)期具有正常的花藥腔室，內(nèi)含小孢子母細(xì)胞（圖3-G），在第10時(shí)期小孢子液泡化后呈圓形，到第12時(shí)期，即使花藥外表皮細(xì)胞皺縮，腔室內(nèi)部分花粉粒發(fā)育飽滿呈圓形，多數(shù)花粉粒干癟內(nèi)無淀粉積累（圖3-I）。

A?野生型春江06的雌蕊形態(tài); B, C?突變體dps2的雌蕊形態(tài); D?春江06胚囊鏡檢; E, F?突變體dps2胚囊鏡檢。Sti?柱頭; ov?子房。在A~C圖中，標(biāo)尺為1 mm；在D~F圖中，標(biāo)尺為50 μm。

Fig. 4. Pistils phenotypic observation of wild type Chunjiang 06(CJ06) andmutant.

表2 dps2突變位點(diǎn)的遺傳分析

2.4 dps2突變體雌蕊發(fā)育異常

突變體有育性正常的花粉粒卻表現(xiàn)為完全不育，因此，我們觀察突變體雌蕊發(fā)育是否受到影響。結(jié)果表明，野生型雌蕊有2枚柱頭和1個(gè)子房，二者發(fā)育正常(圖4-A)，但突變體柱頭和子房皺縮(圖4-B)，部分突變體雌蕊的柱頭數(shù)目增至2~4枚(圖2-C)。透明法觀察胚囊育性發(fā)現(xiàn)，野生型發(fā)育成四核胚囊，胚囊壁正常加厚，助細(xì)胞和反足細(xì)胞消失(圖2-D)，而突變體內(nèi)胚囊中央無極核結(jié)構(gòu)并出現(xiàn)細(xì)胞退化的痕跡(圖2-E)。此外，我們?cè)谕蛔凅w中觀察到胚囊中央有兩個(gè)細(xì)胞核組成的極核結(jié)構(gòu)，助細(xì)胞和反足細(xì)胞均消失(圖2-F)。這說明突變體具有胚囊敗育的特征，但也可能存在育性正常的胚囊。

2.5 突變體遺傳分析

由于突變體植株雄蕊和雌蕊都發(fā)育異常，且突變體完全不育，以代換系中分離出的雜合體和常規(guī)粳稻日本晴及秈稻9311配制雜交組合，育性調(diào)查結(jié)果表明，所有組合的F1植株均表現(xiàn)為可育，在F2群體中發(fā)生育性分離。經(jīng)卡方檢驗(yàn)，育性性狀的分離符合3∶1的分離規(guī)律(χ2<3.84, 表2)。這表明該突變性狀由單基因隱性核基因控制。

2.6 DPS2基因的初定位和精細(xì)定位

利用均勻分布于12條染色體上的250對(duì)多態(tài)性標(biāo)記，對(duì)野生型、突變體、F1及混池(30個(gè)突變體表型單株等量混合)進(jìn)行基因型鑒定，將基因界定在位于第4染色體上的BY4和BY19標(biāo)記之間(圖5-A)。進(jìn)一步擴(kuò)大定位群體，用DNASTAR和Primer 3.0在該連鎖區(qū)間里開發(fā)InDel和dCAPS標(biāo)記，最終利用F2群體中的2353個(gè)突變體表型植株將目的基因定位在BY6-2和BY7-3標(biāo)記之間，物理距離為91.2 kb(圖5-B)。根據(jù)水稻基因組數(shù)據(jù)庫(Rice Genome Annotation Project)中的基因注釋，該區(qū)間內(nèi)共有12個(gè)基因，包含有表達(dá)蛋白、轉(zhuǎn)座子蛋白、C2H2鋅指蛋白等(表3)。

2.7 花藥發(fā)育相關(guān)基因的表達(dá)分析

突變體的雄蕊和雌蕊發(fā)育異常，利用實(shí)時(shí)定量PCR比較了野生型和突變體中花器官發(fā)育相關(guān)基因的表達(dá)量。這些基因包括花器官數(shù)目相關(guān)的、、基因，生長(zhǎng)素調(diào)控相關(guān)的、基因，以及MADS-Box家族中參與雄蕊和心皮發(fā)育的3類基因。結(jié)果表明，與花器官數(shù)目相關(guān)的基因和在野生型和突變體中均未檢測(cè)到表達(dá)，基因在突變體中的表達(dá)量顯著升高；與生長(zhǎng)素調(diào)控相關(guān)的基因、在野生型和突變體中同樣未檢測(cè)到；與野生型相比，MADS-Box家族中的B類基因、、，C類基因、和除了、外的E類基因、、、在中均顯著上調(diào)表達(dá)（圖6）。結(jié)果表明，以上花藥發(fā)育相關(guān)基因的表達(dá)量在中上調(diào)，這很可能導(dǎo)致花器官發(fā)育缺陷。

A?突變基因的初步定位; B?突變基因的精細(xì)定位; C?標(biāo)記BY6-2和BY7-3區(qū)間內(nèi)開發(fā)閱讀框。

Fig. 5. Location ofon rice chromosome 4.

表3 第4染色體候選區(qū)間內(nèi)注釋的12個(gè)基因

3 討論

水稻花器官發(fā)育是一個(gè)非常復(fù)雜的過程，每一步都涉及嚴(yán)格的遺傳調(diào)控，而水稻穎花的異常發(fā)育往往導(dǎo)致育性下降、千粒重減少、結(jié)實(shí)率降低等，從而致使水稻大幅減產(chǎn)[26]。Ikeda等[27]根據(jù)花器官原基形成起始順序?qū)⑺拘∷氚l(fā)育分成8個(gè)時(shí)期，Sp6、Sp7和Sp8分別對(duì)應(yīng)雄蕊原基形成期、心皮原基形成期及胚珠和花粉形成期。在Sp6時(shí)期形成6枚雄蕊原基并呈環(huán)狀排列。在()突變體中，雄蕊的數(shù)目增加，藥室發(fā)育異常，雌蕊無柱頭或柱頭毛，胚囊發(fā)育正常[28]。突變體和突變體具有部分相似的表型，穎花雄蕊數(shù)目為6枚，部分小穗雄蕊數(shù)目增至7到12枚，說明突變體在雄蕊原基形成期就開始出現(xiàn)異常。突變體在花藥發(fā)育過程中花藥室塌陷，內(nèi)無可見小孢子，即使部分花藥能夠形成腔室，內(nèi)部花粉也發(fā)育異常導(dǎo)致大部分花粉敗育。但是約5%的花粉粒具有活性，而突變體植株在成熟期表現(xiàn)為完全不育。突變體雌蕊的柱頭數(shù)目增至2到4枚，胚囊育性異常。此外，突變體呈晚花表型。說明突變體的不育性狀可能由雄蕊和雌蕊發(fā)育異常及開花異常共同造成。

誤差線表示3次生物學(xué)重復(fù)試驗(yàn)的標(biāo)準(zhǔn)差。*和**分別表示野生型春江06和突變體dps2間差異達(dá)0.05和0.01顯著水平（t檢驗(yàn)）。

Fig. 6. Expression profile of the genes involved in the number and development of flower organs ofmutant and wild type Chunjiang 06.

在水稻中，已被報(bào)道主要調(diào)控第2輪漿片和第3輪雄蕊發(fā)育[8]，能和、相互作用，參與調(diào)控花器官的形態(tài)[9]，和在雄蕊原基中有部分重疊的表達(dá)模式[29]。在突變體中，這3個(gè)基因的表達(dá)水平都顯著升高，說明突變體中B類和C類基因的轉(zhuǎn)錄都受到影響。水稻中可能通過介導(dǎo)的調(diào)控途徑影響漿片和雄蕊發(fā)育。另外，和、互作來調(diào)控花分生組織活性[10]。和也能與形成相互作用，影響雄蕊和雌蕊發(fā)育[17]。在突變體中，、、和表達(dá)水平都顯著升高了。因此，我們推測(cè)基因在水稻B、C和E這3類基因調(diào)控途徑中發(fā)揮作用。

遺傳分析及基因定位表明基因是一個(gè)單隱性核基因，位于第4染色體短臂的BY6-2和BY7-3兩個(gè)標(biāo)記之間，物理距離約91.2 kb，該區(qū)間內(nèi)共有12個(gè)注釋基因，包括編碼C2H2型的鋅指蛋白、表達(dá)蛋白、含有ELM2結(jié)構(gòu)域蛋白等。許多含有MYB[30]、鋅指[31]、堿性螺旋-環(huán)-螺旋[32]、MADS[33]和其他DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子被認(rèn)定為具有調(diào)控花器官發(fā)育的功能。其中C2H2型鋅指蛋白可以和DNA、RNA和蛋白質(zhì)結(jié)合，它們不僅參與轉(zhuǎn)錄調(diào)控，還通過獨(dú)特的位點(diǎn)修飾參與染色質(zhì)調(diào)控和RNA代謝[34]。在擬南芥中，基因編碼一個(gè)具有C2H2鋅指DNA結(jié)合域和EAR抑制域的轉(zhuǎn)錄抑制因子[35]，在花發(fā)育過程中參與控制雄蕊原基、心皮原基和胚珠[36, 37]。通過調(diào)節(jié)生長(zhǎng)素和細(xì)胞分裂素這兩個(gè)途徑來抑制B類基因和的表達(dá)，從而實(shí)現(xiàn)其平衡花發(fā)育第3輪和第4輪之間邊界的功能[31, 38]。、和在部分冗余的途徑調(diào)控花分生組織活性[39]。結(jié)合突變體的表型及突變體中B、C和E這3類基因的表達(dá)量變化，推測(cè)基因功能可能與擬南芥的類似，候選基因LOC_Os04g08290編碼C2H2型鋅指蛋白，但通過測(cè)序分析并未發(fā)現(xiàn)該基因和其余11個(gè)基因有堿基突變。因此，推測(cè)基因可能受表觀遺傳調(diào)控，這有待于下一步轉(zhuǎn)基因?qū)嶒?yàn)驗(yàn)證。

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Identification and Fine Mapping ofin Rice

WANG Changjian#, CHEN Long#, DAI Liping, LU Xueli, HE Jinli, YANG Long, HU Jiang, ZHU Li, DONG Guojun, ZHANG Guangheng, GAO Zhenyu, REN Deyong, CHEN Guang, SHEN Lan, ZHANG Qiang, GUO Longbiao, QIAN Qian*, ZENG Dali*

(State Key Laboratory of Rice Biology, China National Rice Research Institute, Hangzhou 310006, China;#These authors contributed equally to this work;*Corresponding auther,E-mail: qianqian188@ hotmail.com; dalizeng@126.com)

【】 Identification and cloning of organ development-related genes can lay a foundation for further study on the molecular mechanism of rice flower development.【】The main agronomic traits and morphological characteristics of floral organs of wild type Chunjing 06 and() mutant were compared under conventional planting conditions in field. The structure of anther was observed under a scanning electronic microscope by paraffin sectioning, and the fertility of pollen and embryo sac was observed by staining. Map-based cloning was used for the gene localization. Quantitative RT-PCR was performed to analyze the relative expression of genes associated with flower development in the wild type and the mutant. 【】Longer heading date, abnormal flowering, shriveled pistils and stamens, increased anthers and stigmas were presented in themutant. Further study revealed that the anther chamber of themutantcollapsed, and no microspores were found. Though some anthers had their chambers, there was no starch accumulation in the shriveled pollen grains, and the embryo sac fertility ofwas also affected. Genetic analysis indicated that the mutant’s phenotype ofwas controlled by a single recessive nuclear gene. Thegene was mapped to a 91.2 kb region on the short arm of chromosome 4. The expression levels of some genes associated with class B, C and E genes in ABCDE model were up-regulated in the mutant. 【】 The abnormal development of stamens and pistils attributed to the complete infertility of themutant, which indicated thatplay an important role in third round of stamen development and the fourth round of pistil development.

rice;; floral organ development; gene mapping

Q755; S511.01

A

1001-7216(2020)02-0115-10

10.16819/j.1001-7216.2020.9122

2019-11-15;

2019-12-27。

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(31971872, 31661143006)；中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院科技創(chuàng)新工程項(xiàng)目。