張海珊 楊雪 章東方 嚴(yán)丹侃 顧江濤 張愛芳

（安徽省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)與農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全研究所，合肥230031；*通訊作者：aifangz＠163.com）

稻瘟病是水稻生產(chǎn)上具有毀滅性的嚴(yán)重病害之一，全球的水稻產(chǎn)區(qū)幾乎都受到不同程度的為害，每年因稻瘟病導(dǎo)致的水稻減產(chǎn)占11%～30%[1-4]，給水稻生產(chǎn)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。實踐證明，培育和種植抗病品種是防治稻瘟病最經(jīng)濟(jì)有效的方式[2-6]。但稻瘟病菌的種群結(jié)構(gòu)及生理小種具有豐富的多樣性，在不同水稻產(chǎn)區(qū)甚至同一水稻產(chǎn)區(qū)的不同年份，稻瘟病菌的種群結(jié)構(gòu)及生理小種也會發(fā)生變化。稻瘟病菌的遺傳多樣性是造成稻瘟病難以控制的主要原因[7]。因此，篩選具有廣譜抗性的稻瘟病抗病基因，進(jìn)而有針對性地開展抗性育種對稻瘟病的防控意義重大。

近年來，隨著分子生物學(xué)技術(shù)的快速發(fā)展，水稻基因組學(xué)研究亦進(jìn)展迅猛，目前至少已有69個稻瘟病抗病位點被定位和鑒定，已報道的主效抗性基因超過100 個[7]，28 個抗病基因被陸續(xù)挖掘出來[2，8-31]，新的抗稻瘟病基因仍在被不斷的挖掘[32]，其中的23個抗病基因為一類編碼NBS-LRR蛋白（Nucleotide-binding siteleucine rich repeats）的主效抗稻瘟病基因，這些抗病基因介導(dǎo)的抗性表現(xiàn)強，育種可操作性強、效果明顯，開展主效抗性基因的鑒定及其應(yīng)用研究的也比較多，為快速、準(zhǔn)確地鑒定不同水稻資源的抗稻瘟病基因型提供了便利[3-4，33-42]。本研究利用10個水稻抗稻瘟病單基因品系，比較了安徽地區(qū)稻瘟病菌的致病力，篩選出對安徽稻瘟病菌群體具有較好抗性的抗病基因；測定了201份水稻品種對稻瘟病的抗性水平及其所攜帶的抗性基因的抗性特點，以期為安徽水稻品種的合理布局和水稻抗稻瘟病育種工作提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試水稻品種

本試驗中所有供試水稻鑒別品種、水稻抗稻瘟病單基因品系由安徽省農(nóng)業(yè)科學(xué)院保存；201份供試品種是長江中下游水稻區(qū)試品種，由中國水稻研究所提供。

1.2 稻瘟病菌的分離和鑒定

采集安徽省稻瘟病常發(fā)區(qū)金寨縣、潛山縣、休寧縣等地的穗頸瘟病樣，并進(jìn)行單孢分離純化得到稻瘟病菌株。

1.3 稻瘟病菌的毒力分析

選用10個不同水稻抗稻瘟病單基因品系（Pia、Pii、Piks、Pik、Pikp、Pizt、Pita、Pib、Pi9、Pita2）對安徽地區(qū)的108個稻瘟病菌株的致病力進(jìn)行測定。

1.3.1 育苗

水稻種子浸種催芽處理2 d，催芽后的種子播種在育秧盤（60 cm×30 cm×4 cm）中，每個育秧盤2行，每行5穴。每個品種播1穴，每穴播種10粒左右。播種后蓋土并置于網(wǎng)室內(nèi)保濕育秧。接種前3～5 d酌施氮肥，保持稻苗嫩綠，待長到 3葉1心時接種稻瘟病菌，每個處理重復(fù)3次。

1.3.2 稻瘟病菌孢子懸浮液制備及接種

挑取稻瘟菌菌塊移到水稻秸稈培養(yǎng)基（玉米粉20 g，水稻秸稈 40 g，瓊脂 20 g，水 1 L，121 ℃，滅菌 20 min）上，25℃下培養(yǎng)7 d，然后放在黑光燈下連續(xù)光照培養(yǎng)3 d，待產(chǎn)生孢子后，用無菌水洗下培養(yǎng)基表面的孢子，并用紗布濾掉菌絲，孢子液濃度約為2×105個孢子/mL，接種量以所有葉片上布滿孢子液為限。接種后置于25℃～28℃的溫室內(nèi)，遮光保濕24～48 h，然后去除遮光條件，并定時噴霧保濕。

1.3.3 抗性頻率調(diào)查統(tǒng)計

調(diào)查時間為接種后7 d?？剐灶l率（RF）=（抗性菌株數(shù)/供試菌株總數(shù)）×100%。

1.4 水稻品種抗性水平和抗性基因的關(guān)系

1.4.1 不同水稻品種中抗性基因的擴(kuò)增

采用 DNeasy Plant Maxi Kit（Qiagen）提取 201 份供試水稻品種的基因組DNA，并保存于-20℃?zhèn)溆谩＠靡压嫉目沟疚敛』騊i9基因序列設(shè)計了特異性引 物 （Pi9-1F：TGCCCAACCTTTACCCACTGTA；Pi9-1R：AACATGAGTAGAAACAAATTAGTTTG），用Pi9引物對（由上海生工生物工程技術(shù)有限公司合成）進(jìn)行PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增程序為：94℃預(yù)變性5 min；94℃變性45 s，55℃退火 45 s，72℃延伸 1 min，34個循環(huán)；72℃延伸10 min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用1%的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測。

1.4.2 不同水稻品種抗性水平鑒定

采用苗期人工噴霧接種的鑒定方法，選擇安徽省代表性菌株3～5個混合噴霧接種，對201份供試水稻品種進(jìn)行田間抗性鑒定，以麗江新團(tuán)黑谷為感病對照，接種后7～10 d，苗瘟充分發(fā)病后（感病對照品種發(fā)病達(dá)7級或以上）進(jìn)行調(diào)查，參照國際統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)調(diào)查發(fā)病情況：0級為高抗（HR）、1級為抗病（R）、3級為中抗（MR），5級為中感（MS）、7級為感?。⊿）、9級為高感（HS）。

2 結(jié)果與分析

2.1 稻瘟病菌的分離與鑒定

從安徽省不同水稻產(chǎn)區(qū)的不同水稻品種上采集了180余份稻瘟病樣品，通過單孢分離純化，共獲得108株稻瘟病菌株。

2.2 安徽稻瘟病菌群體的致病力分析

通過測定108株稻瘟病菌株對10個不同單基因系的致病力（圖1），發(fā)現(xiàn)含有Pi9、Pik和Pizt的單基因系對安徽地區(qū)的稻瘟病菌株整體具有較高的抗性水平，抗性頻率分別為66%、60%和54%，其中以Pi9基因抗性最強，說明安徽地區(qū)的稻瘟病菌對含有Pi9基因的品種致病力弱，篩選或培育具有Pi9抗性基因的水稻品種適宜在安徽稻區(qū)推廣。其次是含有Pii、Pikp、Pitz和Pita2的單基因系，對部分菌株有抗性，在安徽地區(qū)有一定的利用價值。含有Pia、Piks和Pib的單基因系抗性頻率低，利用價值不高。試驗中發(fā)現(xiàn)有少部分稻瘟病菌株具有強致病力，對大部分的抗性基因同時具有毒力。

圖1 108株稻瘟病菌株對10個不同單基因系的致病力測定結(jié)果

表1 供試水稻品種的稻瘟病抗性評價

2.3 水稻品種抗稻瘟病基因Pi9的檢測

用Pi9引物對Pi9-1F/Pi9-1R對201份供試水稻品種進(jìn)行PCR擴(kuò)增及電泳檢測。從201份水稻品種中檢測到67個品種攜帶Pi9抗病基因，比例為33.33%。

對201份水稻品種進(jìn)行田間稻瘟病抗性鑒定的結(jié)果（表1）表明，攜帶Pi9抗病基因的水稻品種發(fā)病程度為感或高感的共計7份，僅占3.49%；不攜帶Pi9抗病基因的水稻品種發(fā)病程度為感或高感的共計70份，占34.83%。說明Pi9基因在水稻品種的稻瘟病抗性中起重要作用。

3 結(jié)論與討論

目前水稻稻瘟病主要是利用化學(xué)農(nóng)藥進(jìn)行防治，容易造成環(huán)境污染，且增加了生產(chǎn)成本，而推廣抗稻瘟病品種是防治稻瘟病經(jīng)濟(jì)且有效的預(yù)防措施，因此篩選抗稻瘟病基因，選育抗病品種可能是有效預(yù)防稻瘟病流行的重要手段。本研究所用的稻瘟病菌株均采自安徽省水稻主要產(chǎn)區(qū)的田間自然發(fā)病的穗頸瘟樣本，較好反映了安徽省稻瘟病菌的群體情況，有助于進(jìn)行稻瘟病生理小種的毒力測定，以及篩選廣譜的抗稻瘟病基因。

近年來，隨著分子生物學(xué)技術(shù)的迅速發(fā)展，通過分子技術(shù)將多個抗病基因聚合到一個品種上，培育出多抗品種普遍認(rèn)為是可行的。目前的多數(shù)研究表明，水稻品種的抗病性與其抗病基因的種類和數(shù)量均有關(guān)，因此加強對抗稻瘟病種質(zhì)資源和抗性基因的挖掘，尋找更加廣譜的抗稻瘟病基因，將多個效果好的抗稻瘟病基因同時導(dǎo)入到綜合性狀優(yōu)良的水稻品種中，可快速提升水稻抗稻瘟病的水平。亦有研究表明，隨著抗性基因數(shù)量的增加，水稻品種的抗病性也呈上升趨勢[31，44-45]。因此，在選擇抗病親本時，須針對同一生態(tài)區(qū)域內(nèi)的生理小種，鑒定對其抵抗力較強的基因類型，在育種過程中聚合其中2個或多個抗病基因，才能提高水稻品種的稻瘟病抗性水平[46]。本研究利用10個常用的主效抗病基因的單基因品系，對安徽地區(qū)的稻瘟病菌群體進(jìn)行了毒力測定，可以直接高效的篩選出對安徽省稻瘟病菌具有廣譜抗性的抗稻瘟病基因，研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，Pi9基因?qū)Π不帐〉疚敛【目剐暂^強，且田間稻瘟病抗性鑒定的表現(xiàn)好，因此，在安徽稻區(qū)適宜選育及推廣含有Pi9及其他多個抗稻瘟病基因的水稻品種。此外，我們在試驗過程中也發(fā)現(xiàn)了部分稻瘟病菌株，其對供試的大部分抗性基因同時具有毒力，其中包括Pi9基因。這一現(xiàn)象表明在今后的品種選育和推廣中，應(yīng)時刻關(guān)注Pi9等抗性基因的抗性水平與生理小種變化之間的關(guān)系，合理利用抗性基因，以預(yù)防因稻瘟病種群變化而導(dǎo)致品種抗性喪失帶來的損失。