施旭婷 賈瑞喆

1.南京醫(yī)科大學附屬常州第二人民醫(yī)院(213000)；2.南京醫(yī)科大學附屬婦產(chǎn)醫(yī)院

產(chǎn)后出血是孕產(chǎn)婦死亡第一大原因，出血量較大時產(chǎn)婦易發(fā)生失血性休克，此時會出現(xiàn)組織灌注減少，發(fā)生無氧代謝，體內(nèi)血液乳酸含量迅速增高并發(fā)生代謝性酸中毒，血液將再次分布以保證腦部和心臟的血液供應，但會促進血管的再次收縮，對細胞造成損傷導致體液、蛋白丟失，惡化缺血情況，發(fā)生多器官衰竭[1]。隨著動脈搭橋、溶栓、心臟外科體外循壞、心肺腦復蘇等技術的應用，組織器官缺血后通過再灌注多數(shù)能夠重建功能并恢復損傷，但存在少部分患者再灌注后出現(xiàn)損傷加重，為缺血性再灌注損傷(IRI)，其中腎臟損傷首當其沖[2]。一些研究提到角化細胞生長因子及其受體(KGF、KGFR)指標一定程度反映了缺血再灌損傷(IRI)的進展，徐苗苗[3]等研究顯示，α-MSH具有抗炎、退熱、抗菌、調(diào)節(jié)能量平衡及心血管功能的作用，對腎臟的缺血/再灌注損傷有一定保護作用；Bertolini[4-5]等研究對這一理論進行了證實。近年來，關于IRI損傷后的修復成為研究熱點，KGFR是KGF的受體，在腎、肺臟器等細胞膜表面具有特異性表達，KGFR與KGF結合具有促進上皮細胞增生、分化、損傷修復等作用[6]。本研究探討了KGF及其受體在產(chǎn)后出血致腎臟缺血再灌注妊娠大鼠中的表達及其保護作用。

1 資料與方法

1.1 一般資料

1.1.1實驗動物選取妊娠足月(孕20d)SD大鼠90只，均為醫(yī)科大學實驗動物室提供，飼養(yǎng)溫度18～22℃，相對濕度65%～70%，自由飲水，定時定量投放清潔鼠糧喂養(yǎng)。

1.1.2實驗試劑及儀器①北京華邁科生物技術公司α-MSH；②美國圣路易斯Sigma-Aldrich化學品公司KGF；③加利福尼亞Santa Cruz 生物技術公司KGFR抗體；④Shimadzu公司Heraeus Picol 17離心機；⑤杭州諾揚生物技術有限公司超純RNA提取試劑盒、cDNA試劑盒；⑥無創(chuàng)血管夾、干燥箱、低溫冰箱、振蕩儀等。

1.2 方法

1.2.1模型及分組將90只大鼠分為生理鹽水組、α-MSH組和對照組各30只。生理鹽水組、α-MSH組建立大鼠產(chǎn)后失血性休克再灌注模型：大鼠腹腔注射10%水合氯醛(350 mg/kg)麻醉，常規(guī)消毒處理后做下腹部正中切口暴露子宮，切開大鼠子宮、孕囊，取出胎鼠后縫合子宮并逐層關閉。剖腹手術完成后于髂總動脈分叉處上方0.5 cm處用無創(chuàng)動脈夾夾閉腹主動脈30 min，然后松開動脈夾再灌注60 min，造成子宮缺血再灌注模型。對照組下腹部正中切口打開腹腔，充分暴露子宮、孕囊，取出胎鼠后縫合子宮，逐層關閉，不進行夾閉動脈。α-MSH組腹腔注射α-MSH 0.5ml/kg及少量生理鹽水使總注射量達4ml，其余兩組注射4ml生理鹽水。

1.2.2標本所有大鼠在造模完成后留取尿液標本，記錄尿量、尿滲透壓(OSM)，12h后完成血樣標本采集即終結大鼠生命，開胸取右肺、右腎組織用于RT-PCR檢測，液氮中快速冷凍，-80℃冰箱保存；注射器穿刺心臟取1.5ml心臟血液靜置，離心處理后取血清置于EP管-20℃保存。生化分析儀檢測血清肌酐(Scr)、尿素氮(BUN)水平。

1.2.3RT-PCT檢測KGF上游引物5-GAGGGACACACGAGAAGTTATGAC-3，下游引物5-CATTTAGCTGATGCAGAGGTGTTG-3，產(chǎn)物大小320bp。KGFR上游引物5-GCATGGTTGACAGTTCTGCCAG-3，下游引物5-CGCTTCAGCCATGACTACTTGC-3，產(chǎn)物大小420bp。

1.2.4腎、肺含水量檢測摘除大鼠右肺、右腎用生理鹽水重復洗凈后矢狀切開，吸除血液稱得濕質(zhì)量，放入烤箱充分烘干后稱得干質(zhì)量，使用干濕重法計算腎、肺組織干濕比。

1.3 觀察指標

觀察對比大鼠肺組織病理改變、腎功能情況及KGF mRNA、KGFR的平均光密度、實時定量水平。

1.4 統(tǒng)計學方法

將數(shù)據(jù)納入SPSS21.0分析，多組計量資料比較采用F檢驗，兩兩比較采用Newman-Keuls檢驗，水平間均值差異較微小使用LSD-t檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 各組大鼠尿量、OSM、Scr及BUN對比

3組大鼠中，生理鹽水組尿量、Scr、BUN水平高于另兩組，尿滲透壓低于另兩組，α-MSH組尿量高于對照組，尿滲透壓低于對照組(P<0.05)，但兩組Scr、BUN水平無差異(P>0.05)。見表1。

表1 各組大鼠尿量、OSM、Scr及BUN對比

2.2 各組大鼠腎、肺含水量

3組大鼠腎、肺含水量，生理鹽水組最高，α-MSH組次之，對照組最低(P<0.05)。見表2。

表2 各組大鼠腎、肺含水量對比

2.3 各組大鼠腎、肺組織KGF mRNA表達水平

3組大鼠腎、肺組織中均能表達KGF mRNA，生理鹽水組表達水平最低，α-MSH組次之， 對照組最高(P<0.05)。見表3。

表3 各組大鼠腎、肺組織KGF mRNA表達

2.4 各組大鼠腎、肺組織KGFR表達

3組大鼠腎、肺組織KGFR平均光密度、實時定量，生理鹽水組最低，α-MSH組次之，對照組最高(P<0.05)。見表4。大鼠腎、肺組織細胞中KGFR蛋白表達見圖1(封三)，可見腎小管上皮細胞、肺泡上皮細胞KGFR蛋白表達呈陽性。

表4 各組大鼠腎、肺組織KGFR平均光密度、實時定量蛋白表達對比

3 討論

腎臟缺血再灌注損傷易導致急性腎衰竭。雖然隨著醫(yī)療水平的不斷進步，醫(yī)療透析技術得到了長足提高，但腎臟缺血再灌注患者的死亡率一直居高不下，主要考慮為腎臟缺血再灌注患者的其他臟器同時會遭到損傷，其中急性肺部損傷最常發(fā)生，從而導致IRI患者的死亡率較高[7]。

KGF表達于間質(zhì)細胞，與KGFR特異性結合，在人體器官穩(wěn)定性中具有積極作用。人體組織損傷對KGF的表達可產(chǎn)生一定影響，其主要經(jīng)過蛋白激酶C完成誘導表達，KGF通路還會受到激素、細胞因子和其他因素的影響[8]。如雌激素、糖皮質(zhì)激素等均可一定程度影響KGF的表達；同時KGF的表達也受到細胞因子影響，如IL-6、IL-8等。KGF與肺、泌尿系統(tǒng)具有聯(lián)系，是早期肺發(fā)育和肺泡II型上皮細胞形態(tài)形成的必備調(diào)控因子，與肺部晚期上皮細胞分化、表面蛋白合成具有密切聯(lián)系。在泌尿系統(tǒng)中，后腎間充質(zhì)、輸尿管芽的生長同KGF具有聯(lián)系， KGF出現(xiàn)缺失易導致腎集合管、腎單位發(fā)育較少[9]。研究KGFR在上皮細胞表面的表達對RIR患者腎臟、肺組織的急性損傷治療有一定意義。

α-MSH是一種神經(jīng)內(nèi)分泌激素，在人體腦部、心臟的缺血性損傷中具有保護作用。近年來科研人員將目光投向α-MSH對腎、肺臟的保護研究中，其作用被越來越多的臨床研究證實[10-11]。α-MSH具有抗氧化、炎癥反應、細胞凋亡等作用，同時刺激保護因子的生成可能也是其在腎肺臟中發(fā)揮保護作用的原因。IRI患者會在脂質(zhì)過氧化作用下形成MDA、氧自由基，其中氧自由基的產(chǎn)生會導致蛋白質(zhì)、細胞外基質(zhì)等產(chǎn)生氧化，從而導致組織內(nèi)微循環(huán)遭到破壞，α-MSH抗氧化的機制可能組織氧自由基釋放、抑制過氧化作用，降低MDA水平。在一些動物實驗中認為，RIR患者的iNOS誘導NO合成能被α-MSH組織影響從而減少硝酸鹽組織濃度，抑制組織水腫，組織興奮性毒性而導致?lián)p傷[12-13]。一些研究表明，α-MSH能夠調(diào)節(jié)大鼠IL-6、IL-8及ICAM-1mRNA水平；同時具備一定的抗炎因子活化刺激作用。從抗細胞凋亡上來看，一些學者指出RIR能夠促進細胞凋亡，α-MSH能夠抑制凋亡機制，起到對上皮細胞的保護作用[14-15]。

本研究中建立產(chǎn)后出血致腎臟缺血再灌注大鼠模型，結果顯示對照組大鼠的尿量顯著少于其余兩組，尿滲透壓水平高于其余兩組，提示產(chǎn)后出血對腎臟存在一定程度影響。NS組大鼠尿量、Scr、BUN水平高于其余兩組，考慮是由于大出血致腎損傷，從而先多尿后少尿，尿量總體增加，腎功能受損水平明顯升高。α-MSH組與對照組Scr、BUN水平無差異，提示經(jīng)α-MSH處理可一定程度保護了腎臟免受大出血影響。在本研究中，各組足月妊娠大鼠腎、肺含水量有一定差異，其中α-MSH組腎、肺臟含水量低于生理鹽水組，對照組含水量最低，提示大出血致腎、肺臟組織出現(xiàn)水腫等病理損傷改變，而α-MSH一定程度改善了水腫情況。3組大鼠的腎、肺組織KGF mRNA表達存在差異性，提示KGF mRNA對腎、肺組織的損傷有一定表現(xiàn)。其中對照組大鼠的腎、肺臟KGF mRNA、KGFR平均光密度水平最高，生理鹽水組最低，α-MSH干預的大鼠水平居中，可見大出血影響了KGF mRNA、KGFR的表達，但α-MSH有一定的KGF mRNA、KGFR調(diào)節(jié)功能，兩者協(xié)同保護腎、肺臟受大出血影響。α-MSH組大鼠的腎、肺臟實時定量水平更趨向于對照組，提示α-MSH對腎、肺臟發(fā)揮了一定保護作用。

綜上所述，角化細胞生長因子及其受體在足月妊娠大鼠腎、肺臟中有表達，在產(chǎn)后出血致缺血再灌注損傷過程中與腎、肺臟損傷存在關聯(lián)。α-促黑素能夠改變角化細胞生長因子及其受體表達，對大鼠腎、肺臟損傷的病理改變有積極作用，對缺血再灌注損傷有一定保護作用，但損傷程度和臨床療效還有待研究論證。