董 青 ， 宋予震 ， 李建華

(1. 吉林大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院 ， 吉林長春130062 ； 2. 河南牧業(yè)經(jīng)濟(jì)學(xué)院 ， 河南鄭州450011)

雞球蟲病(Coccidiosis)是雞常見且危害十分嚴(yán)重的寄生蟲病，是由一種或多種球蟲引起的急性流行性寄生蟲病。該病主要危害10～30日齡的雛雞或35～60日齡的青年雞，發(fā)病率高達(dá)50%～70%，致死率高達(dá)80%[1]。當(dāng)前對球蟲病的控制主要還是依靠抗球蟲藥，但由于抗球蟲藥物的廣泛使用甚至濫用，雞球蟲耐藥性的產(chǎn)生已成為無法避免的問題。因此，疫苗免疫開始成為對雞球蟲病進(jìn)行防治的一個(gè)重要趨勢[2-4]。目前，生產(chǎn)上常用的雞球蟲疫苗為球蟲卵囊弱毒活疫苗[4-6]。但由于雞球蟲特有的發(fā)育繁殖方式，即雞卵囊必須經(jīng)過孢子化過程才具有感染性，因此，卵囊的培養(yǎng)及保存將直接關(guān)系疫苗的成本及免疫的成敗。目前在實(shí)驗(yàn)室中可以使用的卵囊培養(yǎng)液通常為2.5%的重鉻酸鉀溶液[7]。但重鉻酸鉀是一種重金屬化合物，長期使用會(huì)殘留于動(dòng)物機(jī)體和環(huán)境中，影響人類和動(dòng)物健康。隨著人們生活的不斷提高，綠色畜牧業(yè)得到了快速發(fā)展，全社會(huì)對肉食食品安全問題和環(huán)境保護(hù)問題越來越重視。因此，尋找一種穩(wěn)定性好，無污染，具有廣譜殺菌能力的溶液作為雞球蟲卵囊培養(yǎng)液和保存液是必需的。本試驗(yàn)旨在探討氯胺B(苯磺酰氯胺鈉鹽)溶液對雞球蟲病四價(jià)活疫苗(柔嫩艾美耳球蟲、毒害艾美耳球蟲、巨型艾美耳球蟲和堆型艾美耳球蟲)的培養(yǎng)和保存條件，并通過對其孢子化率和免疫保護(hù)效果進(jìn)行檢測，探索保存雞球蟲活疫苗的有效、安全、無毒副作用的方法。

1 材料與方法

1.1 生產(chǎn)用種毒蟲株的來源 柔嫩艾美耳球蟲早熟減毒株(ETZZ株)，分離自河南省鄭州市市郊某雞場；毒害艾美耳球蟲早熟減毒株(ENLY株)，分離自河南省洛陽市某雞場；堆型艾美耳球蟲自然弱毒株(EAXY株)，分離自河南省信陽市某雞場；巨型艾美耳球蟲自然弱毒株(EMZZ株)，分離自河南省鄭州市市郊某雞場。這4種種毒蟲株在河南牧業(yè)經(jīng)濟(jì)學(xué)院進(jìn)行早熟選育，純化后保存。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF雞，由新興大華農(nóng)禽蛋有限公司SPF實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。剛出殼后的1日齡SPF雞放入專用雞盒運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室，在進(jìn)行嚴(yán)格消毒的無球蟲的育雛室內(nèi)飼養(yǎng)至2～4周齡；禽舍的最初溫度控制在30～35 ℃，每周遞減2 ℃，直至室溫，濕度控制在55%～65%；24 h光照；飼喂經(jīng)高壓滅菌、無任何藥物添加的SPF雞全價(jià)育雛顆粒飼料；飲水引自天然泉水，采用純凈水設(shè)備經(jīng)過三重反滲透凈化處理，且加入紫外線和臭氧消毒，確保飲水無球蟲。

1.3 雞球蟲病四價(jià)活疫苗 疫苗由河南牧業(yè)經(jīng)濟(jì)學(xué)院研制。利用成熟早熟選育技術(shù)，在河南省雞球蟲病流行疫區(qū)分離的具有良好免疫原性的柔嫩艾美耳球蟲(Emeriatanella,E.tenella)、堆型艾美耳球蟲(E.acervulina)、巨型艾美耳球蟲(E.maxima)及毒害艾美耳球蟲(E.necatrix)作為雞球蟲病活卵囊疫苗的候選蟲株，研制了雞球蟲病四價(jià)活疫苗(柔嫩艾美耳球蟲ETZZ株+毒害艾美耳球蟲ENLY株+堆型艾美耳球蟲EAXY株+巨型艾美耳球蟲EMZZ株)。

1.4 疫苗檢驗(yàn)用蟲株 柔嫩艾美耳球蟲早熟減毒株(ETAY株)，分離自河南省安陽市某雞場；毒害艾美耳球蟲早熟減毒株(ENSQ株)，分離自河南省商丘市某雞場；堆型艾美耳球蟲自然弱毒株(EALZ株)，分離自河南省林州市某雞場；巨型艾美耳球蟲自然弱毒株(EMPY株)，分離自河南省濮陽市某雞場。這4種疫苗檢驗(yàn)用蟲株在河南牧業(yè)經(jīng)濟(jì)學(xué)院進(jìn)行早熟選育，純化后保存。

1.5 主要試劑 氯胺B，購自百靈威科技有限公司；重鉻酸鉀，購自鄭州科邦生物科技有限公司；甘油，購自天津化學(xué)試劑科技有限公司；食鹽，購自蘭州市鹽業(yè)公司；次氯酸鈉，購自鄭州市德眾化學(xué)試劑公司。

1.6 雞球蟲新鮮卵囊的制備 取生產(chǎn)用4種艾美耳球蟲蟲種溶液，孢子化卵囊計(jì)數(shù)，稀釋成5.0×104個(gè)孢子化卵囊/mL。經(jīng)口感染10只2～4周齡SPF雞，每只接種1 mL(每只雞的感染量為5.0×104個(gè)孢子化卵囊)，分別應(yīng)于感染后118、121、121 h和130 h檢出卵囊。分別收集感染后118～216 h、121～216 h、121～204 h、 130～204 h的糞便并分離卵囊，飽和鹽水漂浮法純化卵囊，然后用20%次氯酸鈉溶液處理卵囊，離心洗滌(3 000 r/min，10 min)，收集卵囊。

1.7 雞球蟲卵囊在氯胺B溶液中的孢子化 配制2.5%的重鉻酸鉀溶液及5種濃度的氯胺B溶液：0.6%、1.2%、2.4%、4.8%、10%；分別將新鮮收集的4種雞球蟲卵囊各分成7組，用100 mL不同濃度氯胺B溶液、高純水和2.5%重鉻酸鉀重懸，每組1.0×106個(gè)卵囊/mL，置于28 ℃水浴搖床震蕩培養(yǎng)。分別于培養(yǎng)后15、20、25、30、40 h和60 h，血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)法記錄孢子化卵囊的數(shù)量，計(jì)算孢子化率。

1.8 無菌檢驗(yàn) 卵囊孢子化結(jié)束后，每組孢子化卵囊按現(xiàn)行《中華人民共和國獸藥典》附錄進(jìn)行無菌檢驗(yàn)。

1.9 雞球蟲病四價(jià)活疫苗在氯胺B溶液中保存時(shí)間的研究

1.9.1 性狀檢驗(yàn)和卵囊計(jì)數(shù) 分別將氯胺B溶液中保存的雞球蟲病四價(jià)活疫苗于2～8 ℃放置0、3、8、11個(gè)月和13個(gè)月，觀察各保存期的疫苗性狀是否發(fā)生變化；通過對各保存期疫苗中孢子化卵囊計(jì)數(shù)，評價(jià)保存時(shí)間對疫苗卵囊數(shù)量的影響。

1.9.2 效力檢驗(yàn) 設(shè)計(jì)5次試驗(yàn)，每次試驗(yàn)分為9組，分別為4個(gè)免疫組、1個(gè)空白組和4個(gè)攻蟲對照組，每組10只SPF雞，分置隔離器內(nèi)飼養(yǎng)(添加薄膜)。5個(gè)批次免疫組試驗(yàn)雞于3日齡分別經(jīng)口接種5個(gè)保存期(于2～8 ℃放置0、3、8、11個(gè)月和13個(gè)月) 的雞球蟲病四價(jià)活疫苗1羽份，接種后21 d進(jìn)行攻蟲試驗(yàn)，相同批次4個(gè)免疫組及相應(yīng)的4個(gè)攻蟲對照組試驗(yàn)雞分別灌服5.0×104個(gè)柔嫩艾美耳球蟲安陽株(ETAY株)孢子化卵囊、5.0×104個(gè)毒害艾美耳球蟲商丘株(ENSQ株)孢子化卵囊、15.0×104個(gè) 堆型艾美耳球蟲林州株(EALZ株)孢子化卵囊、10.0×104個(gè)巨型艾美耳球蟲自然弱毒株(EMPY株)孢子化卵囊，觀察5～7 d，統(tǒng)計(jì)各組存活率，并剖檢所有試驗(yàn)雞，檢查腸道部位(柔嫩艾美耳球蟲檢查盲腸；巨型及毒害艾美耳球蟲檢查小腸中段；堆型艾美耳球蟲檢查十二指腸)的病變并記分。

1.10 氯胺B溶液的安全性試驗(yàn) 配制1.2%氯胺B溶液。取3～5日齡SPF雞20只，隨機(jī)分為2組，試驗(yàn)組10只雞，每只經(jīng)口灌服10倍使用劑量1.2%氯胺B溶液(100 μL)；另10只雞作為空白對照組，分置隔離器中飼養(yǎng)，觀察灌服后7～14 d內(nèi)雞體健康狀況，統(tǒng)計(jì)存活率及相對增重率。

2 結(jié)果

2.1 雞球蟲新鮮卵囊的制備 通過雞體傳代獲得ETZZ株新鮮卵囊4.4×107個(gè)/只、ENLY株2.1×107個(gè)/只、EAXY株7.6×107個(gè)/只和EMZZ株3.1×107個(gè)/只。

2.2 雞球蟲卵囊在不同培養(yǎng)液中的孢子化 4種球蟲卵囊在1.2%的氯胺B溶液中孢子化25～40 h均可達(dá)到90%以上的孢子化率，其中EAXY株在25 h 即可達(dá)到90%以上的孢子化率，而EMZZ株在40 h才可達(dá)到90%以上的孢子化率，ENLY株和ETZZ株卵囊則在30 h即可達(dá)到90%以上的孢子化率，見表1。

表1 4種卵囊在不同培養(yǎng)液中的孢子化率Table 1 Spore rate in different mediums of E. tenella strains

2.3 無菌檢驗(yàn) 除高純水組平板長滿細(xì)菌外，重鉻酸鉀和氯胺B組平板均未生長細(xì)菌。

2.4 雞球蟲病四價(jià)活疫苗在氯胺B溶液中保存時(shí)間的研究

2.4.1 性狀檢測和卵囊計(jì)數(shù) 重懸于氯胺B溶液中的雞球蟲病四價(jià)活疫苗分別于2～8 ℃放置0、3、8、11個(gè)月和13個(gè)月后，性狀均無明顯變化，仍為無色透明液體，瓶底有少許沉淀；卵囊數(shù)量無明顯變化，每羽份疫苗的卵囊數(shù)仍保持為(1 700±170)個(gè)。見表2。

表2 不同保存時(shí)間雞球蟲病四價(jià)活疫苗的卵囊計(jì)數(shù)結(jié)果Table 2 Oocysts of tetravalent live vaccine agaist coccidiosism in different storage times

2.4.2 效力檢驗(yàn) 免疫新鮮雞球蟲病四價(jià)活疫苗于2～8 ℃保存11個(gè)月后仍可以保護(hù)4個(gè)攻蟲蟲株的感染，試驗(yàn)雞剖檢后十二指腸、小腸及盲腸的病變記分均≤1分，而攻蟲對照組各試驗(yàn)雞相應(yīng)腸道的病變記分均≥3分，空白組各試驗(yàn)雞均健康存活。見表3。

表3 雞球蟲病四價(jià)活疫苗(于2～8 ℃保存11個(gè)月)的免疫效力檢驗(yàn)結(jié)果Table 3 Immunization efficiency of tetravalent live vaccine agaist coccidiosis in preservation of 11 months at 2～8 ℃

但四價(jià)活疫苗于2～8 ℃保存13個(gè)月后對4個(gè)攻蟲蟲株的感染保護(hù)力降低，試驗(yàn)雞剖檢后十二指腸、小腸及盲腸的病變記分均≥1分，而攻蟲對照組各試驗(yàn)雞相應(yīng)腸道的病變記分均≥3分，空白組各試驗(yàn)雞均健康存活。

2.4.3 安全性試驗(yàn) 給予10倍使用劑量1.2%氯胺B溶液后14 d內(nèi)，所有試驗(yàn)雞均健康存活，試驗(yàn)組和空白對照組存活率均為100%；試驗(yàn)組與空白對照組各試驗(yàn)雞相對增重率均無明顯差異，試驗(yàn)組和空白對照組相對增重率分別為99.8%和100%。

3 討論

2.5%的重鉻酸鉀溶液常作為雞球蟲卵囊培養(yǎng)液和保存液。它可以殺滅卵囊所攜帶的及環(huán)境中的微生物，減少競爭性氧消耗，有利于雞球蟲卵囊的保存[7]。但是重鉻酸鉀是一種重金屬化合物，長期使用會(huì)殘留于動(dòng)物機(jī)體和環(huán)境中，影響人類和動(dòng)物健康。近年來,我國不少學(xué)者在雞球蟲卵囊培養(yǎng)和保存的開發(fā)和應(yīng)用方面也取得了一些成績。

龔振興等采用山梨酸鉀水溶液作為雞球蟲卵囊培養(yǎng)和保存液，試驗(yàn)證實(shí)，1%～3%山梨酸鉀水溶液對卵囊孢子化不產(chǎn)生影響，且具有明顯的抑菌作用，能顯著提高在4 ℃下長時(shí)間保存的雞球蟲卵囊活力，如應(yīng)用到雞球蟲病活疫苗，將顯著提高疫苗保存期，降低生產(chǎn)成本[8]。

譚志堅(jiān)等采用氯胺T(對甲苯磺酰氯胺鈉)與純凈水以(0.5～8.0)∶100的比例經(jīng)充分搖勻制備而構(gòu)成的氯胺T溶液作為雞球蟲卵囊培養(yǎng)和保存液，經(jīng)過該培養(yǎng)液和保存液處理的球蟲卵囊，其孢子化率高達(dá)80%以上，無菌檢驗(yàn)結(jié)果為陰性，雞球蟲卵囊在4～8 ℃保存9個(gè)月未受影響，效果明顯優(yōu)于傳統(tǒng)的2.5%重鉻酸鉀溶液[9]。

與氯胺T相似，氯胺B為白色或微黃的晶體或粉末，也是一種有機(jī)氯消毒劑，含有效氯26%～28%，易溶于水、穩(wěn)定性好，無污染，是一種具有廣譜殺菌能力的消毒劑。主要用于飲用水食具、水果蔬菜消毒、養(yǎng)殖水質(zhì)和搪瓷器具消毒。還可用于乳牛乳房及擠奶杯的清洗及家畜泌尿道和化膿創(chuàng)的沖洗消毒等。

本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，1.2%的氯胺B溶液中可使雞球蟲卵囊孢子化率提高至90%以上，同時(shí)抑制細(xì)菌的生長，對雞體無毒副作用。同時(shí)疫苗在2～8 ℃保存至11個(gè)月活力仍不受影響，表現(xiàn)出良好的免疫保護(hù)效果。

綜上所述，1.2%的氯胺B溶液可以取代重鉻酸鉀作為雞球蟲活疫苗的培養(yǎng)和保存液。氯胺B溶液的發(fā)現(xiàn)克服了已有技術(shù)的一些缺點(diǎn)，實(shí)現(xiàn)了目前球蟲活疫苗技術(shù)生產(chǎn)工藝上的突破和創(chuàng)新，避免了重金屬物質(zhì)(重鉻酸鉀)或防腐劑(甲醛)在雞體內(nèi)的殘留和環(huán)境污染。