樊兆斌 , 張淑萍 , 葛中東 , 周宛蓉 , 張 凱 , 夏宇欣 , 姜莉莉 , 蔣培紅

(1. 菏澤學(xué)院藥學(xué)院 ， 山東 菏澤 274015 ； 2. 菏澤市食品藥品檢驗(yàn)檢測(cè)研究院 ， 山東 菏澤 274000)

(磷酸丙糖異構(gòu)酶(Triosephosphate isomerase，Tpi)作為一種代謝酶,參與機(jī)體細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的葡萄糖分解代謝，可催化磷酸二羥丙酮(DHAP)與3-磷酸甘油醛(GAP)之間的轉(zhuǎn)化[1],在糖酵解、脂肪酸合成等途徑中發(fā)揮著重要作用[2-3]。目前已從人、兔、鼠、綿羊、牛、果蠅、蚊、黃粉蟲(chóng)等多種生物中克隆了該酶的基因。高等動(dòng)物體內(nèi)Tpi的變異或缺乏會(huì)引起身體多種系統(tǒng)疾病，甚至導(dǎo)致死亡[4-5]。蜜蜂作為重要的農(nóng)業(yè)經(jīng)濟(jì)昆蟲(chóng)，在地球生態(tài)系統(tǒng)中占據(jù)重要地位，并發(fā)揮重要作用。本文旨在對(duì)中華蜜蜂幼蟲(chóng)Tpi基因進(jìn)行克隆、測(cè)序及序列分析，并利用生物信息學(xué)軟件對(duì)該基因編碼蛋白進(jìn)行生物學(xué)信息學(xué)分析，以期為Tpi的功能研究提供有價(jià)值的參考資料。

1 材料與方法

1.1 主要試劑 動(dòng)物組織總RNA提取試劑盒、FastQuant cDNA第一鏈合成試劑盒、2×TaqPCR Master Mix、D 2 000 Marker、質(zhì)粒小提試劑盒、pGM-T載體、T4 DNA 連接酶等，均購(gòu)自天根生化科技(北京)有限公司；限制性內(nèi)切酶BamH I與XhoⅠ，購(gòu)自Thermo Fisher公司。

1.2 主要儀器 PCR儀(ABI美國(guó))，離心機(jī)(湖南湘儀公司)。

1.3 試驗(yàn)動(dòng)物 5～7日齡中華蜜蜂幼蟲(chóng)由本實(shí)驗(yàn)中心提供。

1.4 試驗(yàn)方法

1.4.1 引物設(shè)計(jì) 根據(jù)GenBank中已發(fā)表的意蜂Tpi基因序列(XM_017060592.2)設(shè)計(jì)中華蜜蜂Tpi(AcTpi)基因擴(kuò)增引物F/R，F(xiàn):5′-ATCGGATCCGCCATGGGTCGTAAATT-3′(BamH I位點(diǎn))，R:5′-AGTCTCGAGTCACTGCTTAGCGTTAAC-3′(XhoⅠ位點(diǎn))，引物由華大基因有限公司合成。

1.4.2AcTpi基因PCR擴(kuò)增 按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行蜜蜂幼蟲(chóng)總RNA提取和cDNA合成。以提取的cDNA為模板，用引物F/R進(jìn)行目的基因擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系50 μL:2×TaqPCR Master Mix 25 μL,cDNA 模板 1 μL，上下游引物(10 pmol/L)各 1 μL，ddH2O 22 μL。PCR反應(yīng)程序：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性 30 s，50 ℃退火 30 s，72 ℃延伸 1 min，共35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸 7 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

1.4.3 PCR產(chǎn)物連接、轉(zhuǎn)化及測(cè)序 經(jīng)膠回收試劑盒回收PCR產(chǎn)物，16 ℃條件下過(guò)夜連接pGM-T載體，產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌(DH5α)感受態(tài)細(xì)胞，涂布LB(A+)平板，37 ℃過(guò)夜培養(yǎng)，挑取單個(gè)圓滑白色菌落搖菌并提取質(zhì)粒。經(jīng)PCR篩選陽(yáng)性重組質(zhì)粒，選取3個(gè)陽(yáng)性克隆送華大基因有限公司測(cè)序。

1.4.4 序列分析 使用DNASTAR軟件將擴(kuò)增的AcTpi基因序列與GenBank上已發(fā)表的中華蜜蜂(KP994676.1)、意大利蜜蜂(EU760983.1)、大蜜蜂(XM_006622725.2)、小蜜蜂(XM_003691109.2)、歐洲熊蜂(XM_012314761.2)、東方熊蜂(XM_012389323.2)、紅斑石蜂(XM_029195143.1)、苜蓿切葉蜂(XM_003700486.2)、東南藍(lán)莓蜜蜂(XM_017942917.1)、集蜂(XM_015574859.1)、麥莖蜂(XM_015745758.2)以及短管赤眼蜂(XM_014372053.2)的Tpi基因序列進(jìn)行同源性比對(duì)，由MEGA 5軟件繪制Neighbor Joining系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)；在NCBI中進(jìn)行Tpi基因序列開(kāi)放閱讀框的識(shí)別并翻譯成氨基酸序列。

1.4.5 生物信息學(xué)分析 利用 Protparam在線程序預(yù)測(cè)AcTpi編碼氨基酸的基本理化性質(zhì)；利用NCBI的 Conserved Domain Database對(duì)AcTpi編碼蛋白進(jìn)行氨基酸保守結(jié)構(gòu)域的預(yù)測(cè)。利用Protscale、TMHMM 2.0 等在線軟件分析AcTpi編碼氨基酸序列的疏水性、跨膜結(jié)構(gòu)。采用SignalP-5.0 Server預(yù)測(cè)蛋白信號(hào)肽，利用NetPhos 3.1 Server，NetOGlyc 4.0和NetNGlyc 1.0進(jìn)行潛在磷酸化位點(diǎn)及潛在O、N糖基化位點(diǎn)預(yù)測(cè)。利用網(wǎng)站http://Imed.med.ucm.es/Tools/antigenic.pl進(jìn)行抗原決定簇預(yù)測(cè)。利用ABC pred在線軟件對(duì)AcTpi進(jìn)行B細(xì)胞表位預(yù)測(cè)，利用SOP-MA和Swiss-Model預(yù)測(cè)AcTpi的二級(jí)和三級(jí)結(jié)構(gòu)。

2 結(jié)果

2.1AcTpi基因PCR擴(kuò)增結(jié)果 擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)過(guò)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，得到大小為750 bp的特異性條帶(圖1)，與預(yù)期的片段大小相符。

圖1 AcTpi基因PCR擴(kuò)增Fig.1 Amplification of AcTpi gene by PCRM：D 2 000 DNA相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)； 1:AcTpi PCR產(chǎn)物M:D 2 000 DNA marker； 1:PCR product of AcTpi

2.2AcTpi基因同源性比對(duì)及系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)構(gòu)建 應(yīng)用DNAMAN 軟件分析測(cè)序結(jié)果顯示，AcTpi基因的CDS區(qū)全長(zhǎng)744 bp，共編碼247個(gè)氨基酸，堿基組成分別為A(36.96%)、T(29.44%)、C(11.96%)、G(21.64%)，(G+C)%為33.60%。將AcTpi基因序列與GenBank中參考物種進(jìn)行同源性比對(duì)，結(jié)果見(jiàn)圖2。結(jié)果表明，AcTpi基因與已發(fā)表的中華蜜蜂、意大利蜜蜂、大蜜蜂、小蜜蜂、歐洲熊蜂、東方熊蜂、紅斑石蜂、苜蓿切葉蜂、東南藍(lán)莓蜜蜂、集蜂、麥莖蜂以及短管赤眼蜂的Tpi基因核苷酸序列同源性分別為100%、98.9%、98.3%、96.9%、88.8%、88.6%、88.4%、88%、87.9%、85.1%、78.9%和77.6%。

圖2 中華蜜蜂與其他物種Tpi基因同源性比對(duì)Fig.2 Homology comparison of Tpi gene between Apis cerana cerana and other species注(Note)：Ac：中華蜜蜂(Apis cerana)； Am:西方蜜蜂(Apis mellifera)；Ad:大蜜蜂(Apis dorsata)； Af:小蜜蜂(Apis florea)； Bt:歐洲熊蜂(Bombus terrestris)； Bi:東方熊蜂(Bombus impatiens); Ob:石蜂(Osmia bicornis); Mr:苜蓿切葉蜂(Megachile rotundata)； Hl:東南藍(lán)莓蜜蜂(Habropoda laboriosa)；Dn:集蜂(Dufourea novaeangliae); Cc:麥莖蜂(Cephus cinctus)； Tp:短管赤眼蜂(Trichogramma);下同(The same as below)

利用MEGA 5軟件對(duì)中華蜜蜂與GenBank中參考物種Tpi基因序列繪制Neighbor Joining系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，結(jié)果見(jiàn)圖3。由圖3可見(jiàn)，Tpi基因進(jìn)化樹(shù)總體分為兩大支，中華蜜蜂最先與意大利蜜蜂聚在一起，與大蜜蜂和小蜜蜂聚為一小支，然后再與東南藍(lán)莓蜜蜂、東方熊蜂和歐洲熊蜂聚在一起，之后再與集蜂、苜蓿切葉蜂和野蜂聚為一大支。麥莖蜂和短管赤眼蜂聚為一支。

圖3 中華蜜蜂與其他物種基于Tpi編碼氨基酸序列的分子進(jìn)化樹(shù)Fig.3 The phylogenetic tree based on amino acid sequences of Tpi from Apis cerana cerana and other species

2.3AcTpi編碼氨基酸理化特性及結(jié)構(gòu)域分析 運(yùn)用ExPASy 的ProtParam數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)AcTpi編碼蛋白的理化性質(zhì)預(yù)測(cè)，推測(cè)AcTpi編碼蛋白分子式是C1206H1918N328O359S4， 理論分子量為26.88 kDa，理論等電點(diǎn)為7.76，脂肪指數(shù)為93.52，主要由22 種氨基酸編碼，該蛋白不穩(wěn)定系數(shù)為27.32(<40)，提示該蛋白較穩(wěn)定。對(duì)AcTpi編碼蛋白的氨基酸保守結(jié)構(gòu)域進(jìn)行預(yù)測(cè)分析，結(jié)果如封二彩版圖4所示，AcTpi屬于T細(xì)胞免疫球蛋白域黏蛋白(T cell immunoglobulin domain mucin，Tim)超級(jí)家族，含有1個(gè)保守結(jié)構(gòu)域。

2.4AcTpi編碼蛋白親水性/疏水性、跨膜螺旋結(jié)構(gòu)及修飾結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè) 利用ExPASy ProtScal程序，對(duì)AcTpi基因編碼產(chǎn)物的親/疏水性分析，AcTpi疏水性圖譜如圖5所示，圖中縱坐標(biāo)0值以上為疏水區(qū)，其分值越高，疏水性越強(qiáng)；0值以下為親水區(qū)。整個(gè)多肽鏈有2個(gè)明顯的親水區(qū)，多肽鏈的第135位Ala(A)和第136位Gly(G)分值最低(-2.411)，親水性最強(qiáng)。第42位的Val(V)分值最高(1.911)，疏水性最強(qiáng)；該氨基酸序列內(nèi)超過(guò)半數(shù)為親水性殘基，整條多肽鏈表現(xiàn)為親水性，平均親水指數(shù)為-0.182。

圖5 AcTpi編碼蛋白親/疏水性預(yù)測(cè)Fig.5 The hydrophily/hydrophobicity profile of AcTpi coiding protein

利用在線跨膜區(qū)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)軟件TMHMM 2.0進(jìn)行AcTpi編碼蛋白序列跨膜區(qū)分析，結(jié)果表明，該蛋白不含跨膜區(qū)，均為胞外區(qū)。對(duì)AcTpi基因信號(hào)肽進(jìn)行預(yù)測(cè)結(jié)果表明，該蛋白沒(méi)有信號(hào)肽區(qū)域，不是分泌型蛋白。利用NetPhos3.1 Server 進(jìn)行潛在磷酸化位點(diǎn)預(yù)測(cè)，結(jié)果顯示，閾值0.5 時(shí)，AcTpi存在17個(gè)潛在的磷酸化位點(diǎn)，其中包括8個(gè)蘇氨酸(Thr) (位于肽鏈的第16、48、65、146、171、176、198位和第202位)和9個(gè)絲氨酸(Ser)(位于肽鏈的第18、44、78、95、118、155、192、210位和第234位)。利用軟件NetOGlyc 4.0和NetNGlyc 1.0進(jìn)行潛在O、N糖基化位點(diǎn)預(yù)測(cè)，結(jié)果顯示，AcTpi不存在O-糖基化位點(diǎn)；AcTpi存在3個(gè)潛在的N-糖基化修飾位點(diǎn)，分別位于第14、57、196位氨基酸殘基，概率分別為0.788 4、0.591 8和0.656 7。

2.5AcTpi編碼蛋白抗原決定簇及B細(xì)胞表位預(yù)測(cè) 抗原決定簇預(yù)測(cè)結(jié)果表明，該蛋白的平均抗原傾向指數(shù)為1.020 3，如封二彩版圖6所示，共含有10個(gè)抗原決定簇區(qū)域，分別位于20～29，32～52，64～70， 86～93，108～127，138～146，156～168，179～185，199～209位及225～243位氨基酸殘基。結(jié)果表明，AcTpi編碼蛋白含有較多的優(yōu)勢(shì)抗原表位結(jié)構(gòu)，抗原傾向指數(shù)高。

通過(guò)在線預(yù)測(cè)軟件ABC pred得到可能形成B細(xì)胞線性表位的氨基酸序列區(qū)域?yàn)?82～192、25～35、222～232、202～212、124～134、208～218、166～176、40～50、230～240、132～142、88～98、142～152、74～84、16～26和8～18；使用 IEBD對(duì)AcTpi的B細(xì)胞表位進(jìn)行預(yù)測(cè)，預(yù)測(cè)的區(qū)域?yàn)?1～20、130～139和210～224。綜合兩者的預(yù)測(cè)區(qū)域，兩者重疊區(qū)域可能形成B細(xì)胞線性表位的氨基酸序列為20～25、 130～139和210～218。

2.6AcTpi蛋白高級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè) 使用在線預(yù)測(cè)軟件SOP-MA預(yù)測(cè)AcTpi的二級(jí)結(jié)構(gòu)，結(jié)果表明，該蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)中α-螺旋占45.34%，β-折疊占17.41%，β轉(zhuǎn)角占5.67%，無(wú)規(guī)則卷曲占31.58%。利用SwissModel數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)該蛋白的三維結(jié)構(gòu)，如封二彩版圖7。

3 討論

磷酸丙糖異構(gòu)酶(Tpi)能夠催化磷酸二羥丙酮和D型3-磷酸甘油醛，用于磷酸丙糖異構(gòu)體之間的可逆轉(zhuǎn)換，在糖酵解和脂肪酸合成等途徑中具有非常重要的作用。目前尚未找到替代Tpi酶學(xué)活性的酶類,針對(duì)Tpi的研究主要集中在物理性質(zhì)、催化機(jī)理、催化過(guò)程中能量轉(zhuǎn)換、臨床藥物或疫苗研發(fā)等方面。Tpi作為弓形蟲(chóng)的外分泌蛋白可引起宿主產(chǎn)生強(qiáng)烈的免疫應(yīng)答[6],具有作為弓形蟲(chóng)感染標(biāo)志物開(kāi)發(fā)診斷試劑的潛在價(jià)值[7]。Tpi是世界衛(wèi)生組織(WHO)推薦的最具潛力的血吸蟲(chóng)疫苗候選分子之一[8]。Tpi能夠觸發(fā)天然供體對(duì)1型細(xì)胞因子的免疫應(yīng)答[9]。此外，Niaz課題組研究表明，Tpi是miR-22和miR-28的新靶點(diǎn)，miR-22/28介導(dǎo)的Tpi的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控可能增加腫瘤細(xì)胞糖酵解能力，從而在腫瘤發(fā)生中產(chǎn)生重要意義[10]。

同源性比對(duì)結(jié)果顯示，中華蜜蜂與意大利蜜蜂、大蜜蜂和小蜜蜂Tpi編碼蛋白的同源性較高，序列同源性高達(dá)99.6%、98.4%和97.6%。蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)為蛋白質(zhì)組學(xué)研究提供重要的信息，同時(shí)為深入了解蛋白質(zhì)功能提供重要依據(jù)。本試驗(yàn)克隆得到中華蜜蜂Tpi基因序列，并對(duì)其蛋白的理化性質(zhì)、疏水性、信號(hào)肽、保守區(qū)結(jié)構(gòu)域以及二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行了預(yù)測(cè)分析，對(duì)深入了解中華蜜蜂Tpi基因及其功能研究具有重要意義。跨膜區(qū)預(yù)測(cè)結(jié)果顯示，AcTpi氨基酸序列無(wú)跨膜區(qū)，且氨基酸殘基均位于胞外，是一種外膜蛋白。該蛋白不含信號(hào)肽，不含跨膜區(qū)，極有可能在細(xì)胞內(nèi)參加機(jī)體反應(yīng)?？乖砦挥址Q為抗原決定簇，是抗原分子表面具有特殊結(jié)構(gòu)和免疫活性的化學(xué)基團(tuán)，可刺激機(jī)體產(chǎn)生抗體或致敏淋巴細(xì)胞。在線軟件ABC pred預(yù)測(cè)Tpi編碼蛋白的B細(xì)胞表位，保留得分>0.8的結(jié)果，可提高預(yù)測(cè)準(zhǔn)確性。抗原決定簇預(yù)測(cè)結(jié)果顯示，AcTpi編碼蛋白氨基酸序列含有10個(gè)潛在的抗原決定簇區(qū)域，抗原傾向指數(shù)高，提示該蛋白具有良好的免疫原性，易被免疫系統(tǒng)識(shí)別并產(chǎn)生有效的免疫反應(yīng)。二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)顯示，AcTpi編碼蛋白主要以無(wú)規(guī)則卷曲為主，存在多個(gè)α螺旋和β折疊區(qū)域。結(jié)果為進(jìn)一步闡明中華蜜蜂Tpi在糖酵解過(guò)程中的作用及其功能的開(kāi)發(fā)應(yīng)用提供了科學(xué)依據(jù)。