張中華 ， 吳鳳筍 ， 呂玉金 ， 劉玲玲 ， 張世軍 ， 李文剛

(1.河南農(nóng)業(yè)大學(xué)牧醫(yī)工程學(xué)院 ， 河南 鄭州 450002 ； 2.河南牧業(yè)經(jīng)濟學(xué)院動物醫(yī)藥學(xué)院 ， 河南 鄭州 450046)

豬偽狂犬病(Pseudorabies，PR)是由偽狂犬病病毒(Pseudorabies virus，PRV)引起的多種家畜和野生動物的一種急性、熱性傳染病，主要臨床癥狀為發(fā)熱、奇癢、急性腦脊髓炎和繁殖障礙[1-2]。豬是PRV唯一的自然宿主和儲存宿主，造成妊娠母豬流產(chǎn)，產(chǎn)死胎或木乃伊胎，哺乳仔豬高死亡率，給養(yǎng)豬業(yè)造成極大的經(jīng)濟損失[3-4]。

2011年底，我國PR疫情出現(xiàn)了新的變化[5]，許多免疫過PRV疫苗的豬場和野毒抗體檢測陰性的豬場，甚至是一些已經(jīng)宣布凈化PRV的豬場都出現(xiàn)了PR的疫情。為了解PRV的流行趨勢及變異情況，本試驗對2018年采集于河南省濟源市某豬場的疑似豬偽狂犬病病料組織，進行PRV分離鑒定，以期獲得PRV分離株的生物學(xué)特性，為有效防控PR提供理論參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病料、陽性毒株、細胞及實驗動物 病料組織于2018年1月采集自河南省濟源市某豬場疑似感染PRV的病豬；PRV陽性對照毒株Min-A株、豬腎細胞(PK-15)由本實驗室保存；6周齡SPF級BALB/c雌性小鼠，購自鄭州大學(xué)實驗動物中心。

1.1.2 主要試劑 pMD18-T Vector(2 692 bp)、ExTaq酶、Primer STAR GXL DNA Polymerase，均購自寶生物工程(大連)有限公司；HiPure Viral RNA/DNA Kit，購自廣州美基生物科技有限公司；5×All-In-One RT Master Mix，購自Abcam公司；Ezup柱式病毒DNA抽提試劑盒、SanPrep柱式DNA膠回收試劑盒、SanPrep柱式質(zhì)粒DNA小量抽提試劑盒，均購自生工生物工程(上海)股份有限公司；2×GC-Rich PCR Master Mix、Tailing-A Reaction Kit，均購自天根生化科技(北京)有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 病料組織的采集與處理 在無菌條件下取疑似患豬偽狂犬病病死豬的肺、腎、脾、腦等組織，按1∶5加入PBS充分研磨制成懸液。反復(fù)凍融3次，4 ℃，4 000 g離心15 min，取上清經(jīng)0.22 μm濾膜過濾后放-80 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 引物設(shè)計與合成 PRV、豬細小病毒(Porcine parvovirus，PPV)、圓環(huán)病毒2型(Circovirus type 2，PCV2)、豬繁殖與呼吸綜合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV)、日本乙型腦炎病毒(Japanese encephalitis virus，JEV)和豬瘟病毒(Classical swine fever virus，CSFV)的鑒定引物為本實驗室保存[6]。參照GenBank中發(fā)布的PRV序列(登錄號：JF797219.1)設(shè)計4對引物分別擴增PRVgE、gB、gD、TK基因，參考文獻[7]合成引物擴增gC基因。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

1.2.3 病料組織的PCR鑒定 用HiPure Viral RNA/DNA Kit提取病料組織的RNA/DNA，按照Abcam公司RNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書獲取cDNA。以提取的DNA或cDNA為模板進行PRV、PPV、PCV2、PRRSV、JEV和CSFV的 PCR鑒定。

1.2.4 病毒的分離與純化 將處理過的組織病料上清經(jīng)0.22 μm濾膜過濾并經(jīng)雙抗過夜處理后，接種至PK-15細胞，待細胞病變(Cytopathic effect，CPE)達到80%時收毒。經(jīng)PCR鑒定，3輪空斑純化后，在PK-15細胞上傳代至穩(wěn)定出現(xiàn)CPE時收毒。

1.2.5 分離株半數(shù)組織培養(yǎng)感染劑量(Tissue culture infectious dose 50，TCID50)的測定 取分離株病毒液用細胞維持液作連續(xù)10倍稀釋，按100 μL/孔接種到96孔細胞培養(yǎng)板上，并設(shè)陰性對照，觀察至第4～5天。記錄細胞出現(xiàn)CPE孔數(shù)，取3次重復(fù)試驗的平均值，按照Reed-Muench兩氏法計算病毒的TCID50值。

1.2.6 分離株對小鼠的致病性試驗 將48只6周齡BALB/c雌性小鼠隨機分成6組，分別接種106.71、105.71、104.71、103.71、102.71TCID50/0.1 mL病毒液，同時接種DMEM作陰性對照，接種劑量均為100 μL/只，記錄小鼠的死亡情況，計算分離株的半數(shù)致死量(Median lethal dose，LD50)。

1.2.7 分離株gE、gB、gC、gD及TK基因的克隆、測序鑒定及序列分析 以Ezup柱式病毒DNA抽提試劑盒提取純化的病毒DNA，以此為模板擴增gE、gB、gC、TK、gD基因。將各基因擴增產(chǎn)物用1%(gE、gB)或1.5%(gC、gD和TK)瓊脂糖凝膠電泳檢測，并進行膠回收純化；由于本試驗使用的高保真酶擴增的目的片段為不帶A尾的平末端DNA片段，因此需對目的片段加A后，克隆入pMD18-T Vector。經(jīng)將雙酶切鑒定為陽性的gE、gB、gC、gD、TK重組質(zhì)粒送生工生物工程(上海)股份有限公司測序。

用DNASTAR.Lasergene.v 7.1中的MegAlign與GenBank中收錄的國內(nèi)外其他PRV毒株的gE、gB、gC、gD、TK基因序列進行比較分析，并使用MEGA 7軟件中的Neighbor-Joining方法構(gòu)建氨基酸進化樹，分析PRV分離株的遺傳序列特性。

2 結(jié)果

2.1 病料組織中PRV的PCR鑒定 以病料中提取的DNA為模板，用PRV鑒定引物進行擴增，得到1條約166 bp的條帶，與陽性對照Min-A株得到的條帶大小一致，如圖1；以DNA和cDNA為模板進行其他病原的鑒定，分別得到152、198 bp和91 bp的目的片段，如圖2。結(jié)果表明，病料中不僅有PRV感染，同時有PPV、PRRSV和CSFV混合感染。

圖1 病料組織中PRV的PCR鑒定Fig.1 Identification of PRV in diseased tissue by PCRM：DL-500 DNA相對分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)； 1：陽性對照(Min-A株)；2：待檢病料； 3：陰性對照M：DL-500 DNA marker； 1：Positive control (Min-A strain)； 2： Diseased tissue； 3：Negative control

圖2 病料組織中其他病原的PCR鑒定Fig.2 Identification of other pathogens in diseased tissue by PCRM：DL-500 DNA相對分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)； 1：PPV； 2：PCV2；3：PRRSV； 4：JEV； 5：CSFVM：DL-500 DNA marker； 1：PPV；2：PCV2； 3：PRRSV； 4：JEV； 5：CSFV

2.2 病毒的分離與純化 將處理過的病料組織接種至PK-15細胞，1～2 d后出現(xiàn)明顯的細胞病變。用甲醛結(jié)晶紫溶液對病毒進行空斑染色，對空斑純化后的病毒液進行PCR鑒定，擴增出1條約166 bp的特異性條帶，如圖3，與預(yù)期結(jié)果一致，成功分離到1株P(guān)RV毒株，命名為HNJY。

圖3 空斑純化細胞毒液PRV鑒定Fig.3 Identification of pathogens alter PRV cellsM：DL-500 DNA相對分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)； 1：陽性對照； 2：空斑純化后細胞上清； 3：正常細胞上清M：DL-500 DNA marker； 1：Positive control； 2：Cell supernatant inoculated with PRV； 3：Normal cell supernatant

2.3 分離毒株滴度測定 HNJY株病毒液連續(xù)10倍稀釋，按100 μL/孔接種到96孔細胞培養(yǎng)板上，連續(xù)觀察記錄，10-1～10-8稀釋全部出現(xiàn)CPE，10-9稀釋有2個孔出現(xiàn)CPE，10-10稀釋無細胞病變。采用Reed-Muench兩氏法計算測得分離病毒的TCID50值為108.7/0.1 mL。

2.4 分離株HNJY對小鼠的致病性試驗 TCID50為106.71/0.1 mL感染組小鼠在注射后46 h開始出現(xiàn)臨床癥狀，52 h開始死亡，86 h內(nèi)全部死亡；105.71/0.1 mL感染組121 h內(nèi)死亡5只，其余存活；104.71/0.1 mL感染組在118 h內(nèi)死亡2只，其余存活；103.71/0.1 mL、102.71/0.1 mL和對照組小鼠無死亡。具體情況見表1。采用Reed-Muench兩氏法計算HNJY株對小鼠的LD50為105.31TCID50/0.1 mL。以上感染死亡小鼠均出現(xiàn)奇癢、脫毛、抓咬注射部位、注射部位潰爛等癥狀。

表1 HNJY株LD50的測定Table 1 Determination of LD50 of HNJY strain

2.5 分離株gE、gB、gC、gD和TK基因的擴增gE、gB、gC、gD和TK基因的擴增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果如圖4。分別得到約2 061、2 877、1 696、1 367 bp和1 139 bp的目的條帶，與預(yù)期結(jié)果一致。

圖4 PRV gE、gB、gC、gD及TK基因全長的擴增Fig.4 Full-length amplification of PRV gE、gB、gC、gD and TK gene M1：DL-5 000 DNA相對分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)； M2：DL-2 000 DNA相對分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)； A：gE； B：gB； C：gC； D：gD； E：TK； 1：HNJY株； 2：陽性對照(Min-A株)M1：DL-5 000 DNA marker; M2: DL-2 000 DNA marker； A：gE； B：gB； C：gC； D：gD； E：TK； 1: HNJY strain; 2: Positive control (Min-A strain)

2.6 分離株gE、gB、gC、gD、TK基因核苷酸及氨基酸序列同源性分析 分離株gE、gB、gC、gD、TK基因核苷酸及氨基酸與歐美毒株和國內(nèi)分離毒株進行比較分析。結(jié)果顯示：HNJY分離株的gE、gB、gD、gC基因與國內(nèi)分離株同源性要高于歐美毒株，gC基因與2011年之后分離的國內(nèi)變異株同源性更高一些，TK基因與國內(nèi)外毒株同源性高，該基因保守性高，見表2、3。

表2 HNJY株與參考毒株gE、gB、gC、gD、TK基因核苷酸序列同源性比對Table 2 HNJY strain and reference strains gE,gB,gC,gD,TK gene nucleotide sequence homology alignment (%)

表3 HNJY株與參考毒株gE、gB、gC、gD、TK基因氨基酸序列同源性比對Table 3 HNJY strain and reference strains gE,gB,gC,gD,TK gene amino acid sequence homology alignment (%)

2.7gE、gB、gC、gD、TK基因氨基酸遺傳進化分析 根據(jù)GenBank中已發(fā)表的19株國內(nèi)外參考毒株運用MEGA 7軟件使用Neighbor-Joining方法進行氨基酸進化樹分析。結(jié)果顯示：HNJY株gE、gB、gC、gD基因與歐美毒株在不同的大分支，親緣關(guān)系最遠，與國內(nèi)2011年以前分離的毒株同在1個大分支上，與2011年以后分離的毒株親緣關(guān)系最近；TK基因與來自不同分離年代及地點的PRV分離株親緣關(guān)系均較近，說明TK基因保守性高，見圖5。

圖5 gE、gB、gC、gD、TK基因氨基酸進化樹Fig.5 Amino acid evolution tree of gE,gB,gC,gD and TK genesA:gE; B:gB; C:gC; D:gD; E:TK

2.8gE、gB、gC、gD基因氨基酸序列分析 分離株HNJY株與國內(nèi)分離毒株氨基酸相比只有g(shù)D基因在256位由丙氨酸突變?yōu)樘K氨酸，gE、gB、gC基因氨基酸與國內(nèi)分離毒株沒有變化。與歐美毒株比較gE氨基酸序列有14處差異，gB氨基酸序列有15處差異，gC基因氨基酸序列有6處差異，gD基因在344位由谷氨酰胺突變?yōu)楦彼?，?48位由脯氨酸突變?yōu)樘K氨酸。

3 討論

本試驗分離株HNJY株的TCID50為10﹣8.7/0.1 mL，劉正飛等[8]與陳煥春等[9]測定的國內(nèi)毒株Min-A株和Ea株的TCID50分別為10﹣7.9/0.1 mL 和10﹣8.08/0.1 mL，說明HNJY株與經(jīng)典毒株Ea株和Min-A株的TCID50相當(dāng)，說明近些年P(guān)R的流行與PRV的毒力沒有關(guān)系。通過腹股溝皮下注射小鼠測得LD50為105.31TCID50，Luo等[10]測得TJ株和SC株的LD50分別為102.3TCID50和103.3TCID50；向柯宇[11]測得HeN1株的LD50為102.37TCID50，說明分離株HNJY的致病力相對較弱。

HNJY株與國內(nèi)外參考毒株序列同源性比對結(jié)果分析表明：HNJY株gE、gB、gC、gD基因與國內(nèi)毒株的同源性均高于歐美毒株，且分離株HNJYgC基因與2011年之后的國內(nèi)毒株同源性均高于2011年之前國內(nèi)分離毒株，說明HNJY株屬于近年來國內(nèi)變異株。HNJY株與國內(nèi)外參考毒株氨基酸序列分析結(jié)果顯示：gE氨基酸在59、63、106、149、179、181、215、216、472、474、504、509、522、526位(以中國毒株位置為準(zhǔn))與歐美毒株有差異，與陳超[12]研究歐美毒株和亞洲毒株的氨基酸差異分析結(jié)果一致，說明這些差異可以作為鑒別PRV亞洲毒株和歐美毒株的標(biāo)志。gE基因是PRV主要的毒力基因，氨基酸的差異對PRV毒力的影響，還需進一步的研究。gB氨基酸分析表明，中國毒株和歐美毒株在53、55、70、81、82、83、87、93、94、96、102、557、678、847、854、856、915、921位(以中國毒株位置為準(zhǔn))有差異，推斷這些差異可以作為gB基因鑒定國內(nèi)毒株和歐美毒株的標(biāo)志。gB基因是PRV的重要保護性抗原基因之一[13]，所以gB基因的氨基酸變化對其抗原性的影響如何，還待深入研究。gC氨基酸分析表明，亞洲毒株和歐美毒株在431、449、457、461、467、468位(以亞洲毒株位置為準(zhǔn))有差異，結(jié)果顯示，氨基酸突變位點主要發(fā)生在431～468位。有研究表明，在436～470位氨基酸為gC蛋白跨膜區(qū)，其中含有α-螺旋結(jié)構(gòu)的疏水區(qū)，這一區(qū)域作用是使PRV穩(wěn)定附著在細胞表面[14]。但這一區(qū)域的氨基酸突變對PRV吸附的作用影響如何，還需進一步研究。gD氨基酸分析表明，國內(nèi)分離株與5株歐美毒株相比，在344位由谷氨酰胺突變?yōu)楦彼幔?48位由脯氨酸突變?yōu)樘K氨酸。HNJY株與國內(nèi)外參考毒株相比，在256位由丙氨酸突變?yōu)樘K氨酸，但此氨基酸突變對PRV毒株生物學(xué)特性的影響還需進行深入研究。gE、gB、gC、gD、TK基因氨基酸進化樹分析表明，gE、gB基因可以作為鑒別歐美毒株和亞洲毒株的標(biāo)識基因，gC基因遺傳距離與分離年代有一定聯(lián)系，gD、TK基因遺傳進化與分離年代沒有關(guān)聯(lián)。