劉 輝 ， 佘銳萍 ， 劉天龍 ， 劉 波

(中國農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院 ， 北京 海淀 100193)

血液抗菌肽是從動(dòng)物的血紅蛋白α或β亞基上裂解而來的片段，具有抗菌等多種活性的水解產(chǎn)物[1]。其分子由15～30個(gè)氨基酸殘基組成，分子量低(不足10 kDa)。血紅蛋白抗菌肽是陽離子抗菌肽，呈現(xiàn)α螺旋構(gòu)象，在水溶液或十二烷基硫酸鈉液體以隨機(jī)線圈形式存在[1-3]。這些特性決定了它們?cè)谖舛认戮哂袕V泛抑制微生物的能力[4-5]。血紅蛋白抗菌肽的作用方式是提高細(xì)胞膜的通透性[6-7]。

雞血抗菌肽(Chicken blood antimicrobial peptides，CBAP)屬于天然的禽源抗菌肽，是從雞新鮮血液中提取出大小為3.3 kDa雞血紅蛋白α鏈片段，被證明有廣譜的抗菌活性及家禽免疫調(diào)節(jié)與抗應(yīng)激的功能[8]?？咕?AMPs)對(duì)哺乳動(dòng)物免疫力的重要性往往被低估，首先在植物和無脊椎動(dòng)物中發(fā)現(xiàn)抗菌肽具備強(qiáng)大的免疫功能，隨著對(duì)哺乳動(dòng)物天然免疫防御系統(tǒng)研究不斷深入，AMPs在哺乳動(dòng)物免疫中的重要作用得到確認(rèn)。在微生物病原體的刺激下，動(dòng)物的細(xì)胞在感染或損傷局部部位釋放AMPs[9]。除了抑制微生物生長外，某些AMPs還可以直接募集白細(xì)胞或誘導(dǎo)趨化因子與細(xì)胞因子的分泌，從而間接促進(jìn)單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、未成熟樹突狀細(xì)胞和T細(xì)胞等效應(yīng)細(xì)胞的募集。募集作用是通過與G蛋白偶聯(lián)受體介導(dǎo)的，將樹突狀細(xì)胞和T細(xì)胞招募到微生物入侵的部位，從而促進(jìn)細(xì)胞免疫反應(yīng)[10]。AMPs還可以調(diào)節(jié)動(dòng)物的適應(yīng)性免疫。如防御素作為有效的免疫佐劑，通過誘導(dǎo)淋巴因子的產(chǎn)生，促進(jìn)T細(xì)胞依賴性細(xì)胞免疫和抗原特異性免疫球蛋白的產(chǎn)生[11]。

本次試驗(yàn)重點(diǎn)探索CBAP對(duì)豬的促生長與免疫調(diào)節(jié)作用影響，為開發(fā)綠色無抗促生長添加劑提供新思路。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與耗材 CBAP是由本實(shí)驗(yàn)室按照酶解法從新鮮雞血中提取所得，pH=6.0±0.5，濃度為300 μg/mL。豬外周淋巴細(xì)胞分離試劑盒，購自天津市灝洋生物制品科技有限責(zé)任公司；進(jìn)口胎牛血清，購自Nobimpex公司；DMEM，購自賽默飛世爾公司；1×PBS緩沖液(pH 7.2～7.4)，購自Solarbio公司；脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS)、刀豆蛋白A(Concanavalin A，ConA)、WST-8細(xì)胞技術(shù)試劑盒，均購自北京鈕因華公司；豬補(bǔ)體C3、C4 ELISA試劑盒、豬γ-干擾素ELISA試劑盒，均購自Dogesce公司；豬偽狂犬病(Porcine pseudorabies，PR)gB抗體ELISA檢測(cè)試劑盒，購自Biochek公司；經(jīng)典豬瘟(Classical swine fever，CSF)抗體ELISA檢測(cè)試劑盒，購自美國愛德士公司；豬口蹄疫(Foot-and-mouth disease，F(xiàn)MD)O型、A型液相阻斷ELISA檢測(cè)試劑盒，均購自金宇保靈生物藥品有限公司。

1.2 主要儀器 無菌超凈臺(tái)，美國Labconco公司產(chǎn)品；低速離心機(jī)LD5-2，北京醫(yī)用離心機(jī)廠產(chǎn)品；倒置式生物電子顯微鏡，北京東南儀誠公司產(chǎn)品；紫外分光光度計(jì)，Bio-rad公司產(chǎn)品；II級(jí)生物安全柜，山東博科生物產(chǎn)業(yè)有限公司產(chǎn)品；CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱，Thermo公司產(chǎn)品；BKQP-100L立式高壓蒸汽滅菌器，山東鑫貝西公司產(chǎn)品；電熱恒溫培養(yǎng)箱，北京陸?？萍加邢薰井a(chǎn)品。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 65日齡美系純種杜洛克豬，購自北京六馬集團(tuán)。

1.4 試驗(yàn)方法

1.4.1 試驗(yàn)時(shí)間與地點(diǎn) 2019年8月8日—2019年9月8日，共30 d，試驗(yàn)地點(diǎn)為北京六馬集團(tuán)順義豬場。

1.4.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì) 根據(jù)體重、健康狀況等同性原則隨機(jī)分為2組，每組10頭，對(duì)照組10頭(基礎(chǔ)日糧)，CBAP組10頭(基礎(chǔ)日糧+300 μg/mL、10 mL/d CBAP飲水)。CBAP通過10 mL的注射器(去掉針頭)直接注入豬的口腔里，飼料為干濕料，每天早、中、晚各加料1次，飼養(yǎng)試驗(yàn)為30 d?？紤]陽光因素，2組試驗(yàn)都有陽面和陰面?；A(chǔ)日糧為六馬集團(tuán)生產(chǎn)加工的保育料，保育豬采用地面欄舍飼養(yǎng)，試驗(yàn)期保持豬舍衛(wèi)生、消毒。免疫按照豬場管理流程執(zhí)行，試驗(yàn)豬舍要適當(dāng)通風(fēng)，保持豬舍安靜。免疫程序見表1。

表1 保育豬免疫程序Table 1 Immunization program for nursery pigs

1.4.3 生長指標(biāo)的測(cè)定 試驗(yàn)過程中，每天觀察豬群2～3次，記錄保育豬腹瀉與死亡情況。(1)日增重：分別在試驗(yàn)的第1天、第30天，早晨7:30左右空腹逐頭進(jìn)行稱重，計(jì)算出試驗(yàn)期間仔豬的日增重。試驗(yàn)期日增重/頭=(試驗(yàn)?zāi)谄骄?試驗(yàn)初欄平均重)/試驗(yàn)天數(shù)；(2)平均日采食量：以欄為單位，每欄每天總采食量，連續(xù)相加30 d，再求平均值。平均日采食量=采食量/飼養(yǎng)天數(shù)；(3)死亡率：30 d內(nèi)死亡頭數(shù)/每欄總頭數(shù)×100%；(4)飼料料肉比=頭平均采食量/頭平均日增重；(5)腹瀉頭數(shù)：每天查看豬群狀態(tài)，統(tǒng)計(jì)腹瀉發(fā)病情況與數(shù)量。

1.4.4 免疫指標(biāo)測(cè)定 (1)在試驗(yàn)第0、10、20天和第30天各組分別對(duì)固定的5頭豬(準(zhǔn)備屠宰)進(jìn)行采血，分離血清，標(biāo)記好，4 ℃保存，一并測(cè)定豬瘟(CSF)、狂犬病(PR)、豬口蹄疫(FMD)3種抗體和細(xì)胞免疫指標(biāo)(血清補(bǔ)體C3、C4，γ-干擾素);(2)采集8頭豬的脾臟，制作脾淋巴細(xì)胞，測(cè)定淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率。抗體檢測(cè)與脾淋巴細(xì)胞提取按照試劑盒說明書步驟完成。

1.5 數(shù)據(jù)分析 使用Graphpad prism 8.0軟件進(jìn)行顯著性差異分析與圖表繪制,以P<0.05為差異顯著性判斷標(biāo)準(zhǔn)。

2 結(jié)果

2.1 CBAP對(duì)保育豬生長指標(biāo)的影響 使用CBAP對(duì)豬群進(jìn)行30 d的飼喂，如表2與圖1所示，試驗(yàn)?zāi)┢骄w重，CBAP組比對(duì)照組多3.42 kg，增重了8.2%，差異顯著(n=10，P<0.05)。CBAP組的平均日增重比對(duì)照組多88 g/d，提高了13.7%，差異顯著(n=10，P<0.05)。CBAP組料肉比與對(duì)照組相比下降0.18，下降了10.4%，差異顯著(n=10，P<0.05)。 說明CBAP對(duì)豬群的生長有很好的促進(jìn)作用，在采食量大體一致的情況下(1 050 g/d vs 1 103 g/d)， CBAP組有更好的飼料轉(zhuǎn)化率。從控制腹瀉角度來說，對(duì)照組在試驗(yàn)期間共出現(xiàn)4頭腹瀉豬只，而CBAP組只有1頭，差異顯著(n=10，P<0.05)。說明CBAP對(duì)控制豬群腹瀉效果較為明顯，這可能與維持豬群腸道健康有關(guān)。

圖1 CBAP對(duì)保育豬生長指標(biāo)的影響Fig.1 Effect of CBAP on growth indexes of nursery pigs*：P<0.05，差異顯著； 無標(biāo)記：P>0.05，差異不顯著;下同*:P<0.05,the difference was significant; No marker:P>0.05, the difference was not significant. The same as below

表2 CBAP對(duì)保育豬生長指標(biāo)的影響Table 2 Effects of CBAP on growth indexes of nursery pigs

2.2 CBAP對(duì)保育豬血清中免疫指標(biāo)的影響 在試驗(yàn)第0、10、20天和第30天分別采集對(duì)照組和CBAP組各5頭豬血清，測(cè)定補(bǔ)體C3、C4、γ-干擾素。結(jié)果見圖2。血清補(bǔ)體C3(n=5)的結(jié)果見圖2A，在第20～30天的CBAP組血清補(bǔ)體C3濃度顯著高于對(duì)照組(P<0.05)，而在試驗(yàn)開始到20 d，CBAP組與對(duì)照組差異不顯著(P>0.05)；血清補(bǔ)體C4(n=5)的結(jié)果見圖2B，與C3結(jié)果一致，也是在第20～30天 的CBAP組中的血清補(bǔ)體C4濃度顯著高于對(duì)照組(P<0.05)。 其他時(shí)間效果與對(duì)照組不顯著(P<0.05)。 γ-干擾素結(jié)果如圖2C，在第10天及第20天2個(gè)時(shí)間點(diǎn)CBAP組與對(duì)照組差異都不顯著(n=5，P>0.05)，而在試驗(yàn)第30天CBAP組豬血清中的γ-干擾素明顯高于對(duì)照組(P<0.05)。

圖2 CBAP對(duì)保育豬天然免疫指標(biāo)的影響Fig.2 Effect of CBAP on innate immune indexes of nursery pigsA：血清補(bǔ)體C3； B：血清補(bǔ)體C4； C：γ-干擾素A:Serum complement C3; B:Serum complement C4; C:Interferon-γ

2.3 CBAP對(duì)保育豬脾淋巴細(xì)胞增殖的影響 飼喂CBAP 30 d，豬淋巴細(xì)胞增殖作用結(jié)果如圖3所示，由ConA刺激的T淋巴細(xì)胞的轉(zhuǎn)化率(n=4)的結(jié)果顯示，CBAP組要極顯著高于對(duì)照組(P<0.01)，由LPS刺激的脾B淋巴細(xì)胞增殖作用(n=4)顯示，CBAP組要極顯著高于對(duì)照組(P<0.01)，與T淋巴細(xì)胞的轉(zhuǎn)化率結(jié)果一致。

圖3 豬脾淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化試驗(yàn)Fig.3 Lymphocyte transformation test of pig spleen

2.4 CBAP對(duì)保育豬體液免疫指標(biāo)的影響 試驗(yàn)期的第0、10、20天和第30天分別采集對(duì)照組和CBAP組各5頭豬只血清，檢測(cè)豬瘟，偽狂犬gB，口蹄疫O型、A型抗體，具體結(jié)果如下：CBAP對(duì)豬瘟疫苗的效果如中插彩版圖4A所示，與對(duì)照組相比，CBAP對(duì)豬瘟的抗體效價(jià)與合格率均無明顯改善，差異不顯著(n=5，P>0.05)，這可能由于CBAP對(duì)活豬瘟疫苗病毒有一定的影響，導(dǎo)致對(duì)疫苗抗體效果提高不明顯。CBAP對(duì)豬偽狂犬疫苗的效果如中插彩版圖4B所示，與對(duì)照組相比，在第30天gB抗體效價(jià)差異顯著(n=5，P<0.05)，其他時(shí)間段差異不顯著。CBAP對(duì)偽狂犬滅活苗產(chǎn)生抗體有很好的促進(jìn)作用。CBAP對(duì)豬口蹄疫疫苗O型抗體的效果如中插彩版圖4C所示，本場口蹄疫疫苗第1次免疫在60 d，第2次免疫在90 d，飼喂CBAP 30 d后，CBAP組對(duì)豬口蹄疫O型抗體滴度有明顯的改善作用，在第10天CBAP組抗體滴度極顯著高于對(duì)照組(n=5，P<0.01);在第20天與第30天采血檢查，CBAP組抗體滴度顯著高于對(duì)照組(n=5，P<0.05)。CBAP對(duì)豬口蹄疫疫苗A型抗體的效果如中插彩版圖4D所示，試驗(yàn)期間的第10天與第30天CBAP組要明顯優(yōu)于對(duì)照組，抗體效價(jià)差異極顯著(n=5，P<0.01)。第20天CBAP組顯著高于對(duì)照組，抗體效價(jià)差異顯著(n=5，P<0.05)。說明CBAP可很好地促進(jìn)口蹄疫A型抗體產(chǎn)生。

3 討論

3.1 抗菌肽對(duì)豬群的促生長作用 抗生素作為動(dòng)物飼料促生長添加劑已有50多年的歷史。然而，飼料中抗生素增加動(dòng)物機(jī)體產(chǎn)生耐藥性機(jī)會(huì)，天然抗菌肽不但可以促進(jìn)動(dòng)物生長，提高各項(xiàng)免疫指標(biāo)，且作用穩(wěn)定，安全可靠，是理想的促生長添加劑替代品。本次試驗(yàn)選用大保育豬作為研究應(yīng)用對(duì)象，體重在20 kg以上，每天每頭飼喂300 μg/mL、10 mL/d，經(jīng)過1個(gè)月飼喂周期，與對(duì)照組相比，日增重提高了13.7%，料肉比下降了10.4%，腹瀉率下降了30%。表現(xiàn)出較好的促生長和抗腹瀉效果。

3.2 抗菌肽對(duì)豬群的免疫促進(jìn)作用 抗菌肽的免疫增強(qiáng)活性一直是研究的熱點(diǎn)之一，其獨(dú)有的雙重平衡機(jī)體特性，可以直接通過抗菌活性和刺激固有免疫功能(炎癥、傷口修復(fù)和適應(yīng)性免疫系統(tǒng)的調(diào)節(jié))保護(hù)宿主免受潛在有害病原體的侵害。同時(shí)，還保護(hù)機(jī)體免受過度炎癥反應(yīng)的有害影響。本試驗(yàn)從下面兩個(gè)方面討論抗菌肽與免疫的關(guān)系。

3.2.1 抗菌肽與天然免疫 補(bǔ)體(Complement,C)是血漿蛋白的正常組成成分，存在于人與動(dòng)物血漿中一組無活性的分泌蛋白和膜結(jié)合蛋白前體。激活補(bǔ)體系統(tǒng)過程中，會(huì)產(chǎn)生多種活性分子參與機(jī)體的抗感染免疫，調(diào)節(jié)細(xì)胞與體液免疫效應(yīng)，介導(dǎo)炎癥反應(yīng)。血清中補(bǔ)體C3、C4含量反映機(jī)體的免疫水平。王靜(2007年)研究發(fā)現(xiàn)，飼喂抗菌肽粗提的肉雞，21日齡血清補(bǔ)體 C3、C4含量要明顯高于對(duì)照組[12]。本試驗(yàn)使用CBAP飼喂豬群30 d后發(fā)現(xiàn)，在試驗(yàn)第10天時(shí)，CBAP組豬的血清補(bǔ)體C3、C4含量逐步要高于對(duì)照組，在第20～30天，試驗(yàn)組的C3、C4含量要顯著高于對(duì)照組，這說明抗菌肽對(duì)補(bǔ)體系統(tǒng)有很好的促進(jìn)作用，這與王靜的研究結(jié)果相一致。γ-干擾素由活化T細(xì)胞和自然殺傷細(xì)胞產(chǎn)生，具有較強(qiáng)的免疫調(diào)節(jié)功能。它可以調(diào)節(jié)T、B淋巴細(xì)胞的功能，小劑量時(shí)起促進(jìn)作用，大劑量卻表現(xiàn)為抑制。本試驗(yàn)對(duì)飼喂CBAP的豬群血清進(jìn)行γ-干擾素檢查發(fā)現(xiàn)，對(duì)照組相比，飼喂CBAP組在第30天γ-干擾素明顯高于對(duì)照組。脾淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率的高低可以反映機(jī)體的細(xì)胞與體液免疫水平，本次試驗(yàn)飼喂30 d CBAP后，各組取4頭豬的脾臟，分離淋巴細(xì)胞，用ConA作為T淋巴細(xì)胞有絲分裂原，用LPS作為B淋巴細(xì)胞有絲分裂原，刺激測(cè)定細(xì)胞轉(zhuǎn)化率結(jié)果發(fā)現(xiàn)，對(duì)照組相比，CBAP組的對(duì)T、B淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率均極顯著地提高(P<0.01)。說明CBAP可以有效緩解動(dòng)物的免疫抑制。

3.2.2 抗菌肽與體液免疫 AMPs不但可以調(diào)節(jié)先天性免疫，而且對(duì)適應(yīng)性免疫也有很好的促進(jìn)作用。將卵清蛋白(OVA)與α-防御素HNP1-3聯(lián)合應(yīng)用于小鼠，與單獨(dú)使用OVA相比，聯(lián)合使用可以增加OVA的IgG抗體水平[13]。蜂毒肽(Melittin)是一種24個(gè)氨基酸的多肽，存在于蜂毒中，具有很強(qiáng)的疫苗佐劑活性。使用這種肽結(jié)合破傷風(fēng)類毒素(TT)或白喉類毒素(DT)抗原鼻腔免疫小鼠，血清抗TT和抗DT IgG明顯高于單獨(dú)接種抗原小鼠[14]。這可能是由于AMPs通過誘導(dǎo)共刺激分子促進(jìn)IDCs的成熟，在APC與抗原接觸時(shí)來調(diào)節(jié)淋巴細(xì)胞反應(yīng)，改變細(xì)胞因子的表達(dá)，導(dǎo)致抗原攝取增加。從而促進(jìn)更有效的抗原提呈及后續(xù)更強(qiáng)大的T細(xì)胞活化。但要考慮抗菌肽自身的免疫原性，因此建議使用短肽(<15氨基酸)作為免疫佐劑。本次試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)CBAP對(duì)豬瘟抗體效果不顯著，這可能是由于豬瘟是弱毒疫苗，有囊膜，CBAP對(duì)其也有一定的殺滅或者抑制體內(nèi)增殖作用。因此影響了其抗體的產(chǎn)生，但CBAP也對(duì)免疫有一定促進(jìn)作用，最后結(jié)果表現(xiàn)出差異不顯著。本試驗(yàn)中豬偽狂犬第2次免疫采用的是滅活疫苗，CBAP對(duì)其抗體的產(chǎn)生有明顯的促進(jìn)作用?？谔阋逴、A抗體與偽狂犬一致，在抗體效價(jià)上，CBAP組要明顯優(yōu)于對(duì)照組(P<0.05)。根據(jù)本次試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，CBAP對(duì)弱毒苗效果不是很理想，但對(duì)滅活苗的效果比較好。