余河玲 朱師良 何啟牮 王彥

摘要：本試驗通過構建PDPK1基因3′UTR雙熒光素酶報告載體，并驗證gga-miR-148a-5p與PDPK1的靶向關系。利用生物信息學軟件預測gga-miR-148a-5p與PDPK1結合位點;利用PCR擴增PDPK1基因3′UTR序列，將其克隆到PGL3-CMV-LUC-MCS雙熒光素酶報告基因載體中;將gga-miR-148a-5p及陰性對照分別與野生型gga-PDPK1-WT-3′UTR雙熒光素酶報告質粒共轉染至293T細胞中，雙熒光素酶報告系統(tǒng)檢測各組熒光素酶活性。Targetscan、miRbase數據庫預測結果顯示，gga-miR-148a-5p與PDPK1基因3′UTR存在互補結合位點;酶切及測序結果表明，雙熒光素酶報告載體構建成功;熒光素酶活性試驗結果表明，gga-miR-148a-5p mimics能夠與PDPK1基因3′UTR結合并抑制熒光素酶活性。gga-miR-148a-5p能夠與PDPK1靶向性結合，PDPK1是gga-miR-148a-5p的靶基因。

關鍵詞：PDPK1;gga-miR-148a-5p;禽白血病;雙熒光素酶報告基因檢測系統(tǒng)

中圖分類號：Q783文獻標識碼：A文章編號：1000-4440（2020）01-0147-05

Abstract：In this study， the PDPK1 gene 3′UTR dual luciferase reporter vector was established， and the targeting relationship between gga-miR-148a-5p and PDPK1 was verified. Bioinformatics software was used to predict the binding site of gga-miR-148a-5p and PDPK1. The 3′UTR sequence of PDPK1 gene was amplified by PCR and cloned into PGL3-CMV-LUC-MCS dual luciferase reporter vector. The gga-miR-148a-5p and negative control were cotransfected with wild-type gga-PDPK1-WT-3′UTR dual luciferase reporter plasmid into 293T cells， and the luciferase activity of each group was detected by dual luciferase reporter system. Prediction results from Targetscan and miRbase databases showed that there were complementary binding sites between gga-miR-148a-5p and the 3′UTR of PDPK1 gene. The enzyme digestion and sequencing results showed that the dual luciferase reporter vector was successfully constructed. The results of luciferase activity assay indicated that gga-miR-148a-5p mimics could bind to the 3′UTR of PDPK1 gene and inhibit luciferase activity. The gga-miR-148a-5p can bind to PDPK1， and PDPK1 is the target gene of gga-miR-148a-5p.

Key words：PDPK1;gga-miR-148a-5p;avian leukosis;dual luciferase reporter gene detection system

禽白血病是由禽白血病病毒（Avian leukosisvirus，ALV）引起的，是雞三大腫瘤性疾病（馬立克氏病、白血病、網狀內皮增生癥?。┲凶钕缺蝗藗冴P注并研究的一種禽類疾病。該疾病是由反轉錄病毒科（Retroviridae）禽白血病病毒（又稱肉瘤病毒群病毒）（ ALV）引起的以造血細胞惡性增生為主的多種腫瘤性疾病的統(tǒng)稱[1]。據報道，在一些中國雞群中，ALV-J可誘導各種腫瘤的發(fā)生[2-3]，導致雞晚期發(fā)病和急性腫瘤[4-5]，且具有高達60%的發(fā)病率和20%的死亡率[2]。由于ALV-J具有極高的突變率和重組率，且極易導致其宿主范圍和毒性改變，可導致腫瘤、免疫缺陷、白血病和淋巴瘤。因此，研制相關疫苗存在一定難度。除此之外，在實際生產中，禽白血病病毒的傳播方式也給禽白血病的防治帶來了一定的難度。

3-磷酸肌醇依賴性蛋白激酶-1（PDK1或PDPK1）是屬于AGC激酶家族的古老絲氨酸-蘇氨酸激酶，具有作為AGC激酶的主要調節(jié)劑的特性[6]。眾所周知，許多腫瘤是由關鍵信號傳導途徑的失調引起的。而PDPK1上游信號蛋白的改變，例如酪氨酸激酶受體的激活、PI3K組成型活化及PTEN功能喪失，都可以引發(fā)人類癌癥。同時，PDPK1的多個下游效應物，如Akt、p90RSK、p70S6K、PKC和SGK，與癌癥惡化趨向及更具侵襲性的疾病有關。例如，在人體前列腺癌中，與原發(fā)性腫瘤相比，含有PDPK1基因的基因座在淋巴結轉移和去勢抵抗性前列腺癌中常被檢測到[7];在人體食管鱗狀細胞癌中，與鄰近的非癌組織相比，腫瘤細胞中PDPK1蛋白表達更高。此外，PDPK1的高表達與晚期腫瘤分期（陽性淋巴結轉移或高組織學分級）和較短的總生存期相關[8]。例如，PDPK1在40%以上的急性髓性白血病患者中過度表達，PDPK1高表達的患者呈現較差的治療結果，且比PDPK1低表達的患者存活時間更短[9]。

hsa-miR-148a位于雞7號染色體，包含68個核苷酸序列。而gga-miR-148a位于雞2號染色體上，有68個核苷酸序列。miR-148a的表達已在人、小鼠、大鼠和斑馬魚中得到證實，但尚未在雞中得到驗證。在正常生理條件下，miR-148a在各種人體組織中表達，包括腦、心臟、肝臟、胸腺、胰腺、腎、胎盤、子宮、睪丸和造血系統(tǒng)等[10-12]。miR-148a的表達下調可以在多種癌癥中檢測到，包括胃癌、結腸直腸癌、胰腺癌、肝癌、食道癌、乳腺癌、非小細胞肺癌和泌尿生殖系統(tǒng)癌癥。本試驗室前期發(fā)現gga-miR-148a-5p在40日齡的禽白血病患病雞和未患病雞的脾臟組織中存在差異表達，但目前對于其與PDPK1的靶向關系尚未報道。本研究采用生物信息學方法對gga-miR-148a-5p的直接作用靶基因及作用位點進行分析，并通過雙熒光素酶報告基因系統(tǒng)分析gga-miR-148a-5p是否能靶向調控PDPK1基因，為進一步研究gga-miR-148a-5p在雞抗禽白血病育種中的應用提供理論基礎。

1材料與方法

1.1試驗材料

人腎上皮細胞（293T）、大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞、雙熒光素報告基因載體（PGL3-CMV-LUC-MCS）均購自上海吉滿公司，膠回收試劑盒購自凱杰生物技術有限公司（上海），小提質粒試劑盒購自OMEGA公司，LipofectamineTM2000購自Invitrogen公司（美國），Taq polymerase、DNA ladder購自TaKaRa寶生物（大連）科技有限公司，Hieff Clone Plus One Step Cloning Kit購自YEASEN，瓊脂糖購自上海前塵生物有限公司，Mlu I、Xho I內切酶購自Fermantas公司，胎牛血清、DMEM、胰酶均購自GIBICO公司（美國），引物合成及測序由生工生物工程（上海）有限公司完成。二氧化碳培養(yǎng)箱，SHELLAB公司產品;熒光倒置顯微鏡，Nikon公司產品;CFX96熒光定量PCR儀，Bio-Rad公司產品;超低溫冰箱，Thermo公司產品。

1.2試驗方法

1.2.1gga-miR-148a-5p靶基因的預測及靶基因富集前期課題組曾對miRNA與雞白血病之間的關系進行了探究，通過采集40日齡患病雞和健康雞的脾臟組織進行全轉錄組測序，最終篩選出了7個差異表達的miRNA（gga-miR-205a、gga-miR-21-5p、gga-miR-383-5p、gga-miR-203、gga-miR-223、gga-miR-148a-5p、gga-miR-21-3p）。在此基礎上，首先，通過使用miRDB、TargetScan7.1等生物信息學軟件預測gga-miR-148a-5p靶基因，求其交集。然后，利用生物信息學軟件DAVID將靶基因的交集在NF-kB信號通路進行靶基因富集，最終選定PDPK1作為gga-miR-148a-5p的靶基因。

1.2.2構建PDPK1野生型雙熒光素酶報告基因質粒本試驗結合miRDB軟件和NCBI數據庫，找到PDPK1與gga-miR-148a-5p的結合位點（http：//www.mirdb.org/cgi-bin/target_detail.cgi？targetID=541541），共構建3個PDPK1基因3′UTR野生型報告基因質粒。選用的載體為PGL3-CMV-LUC-MCS（上海吉滿生物科技有限公司提供），首先通過雙酶切的方法得到線性化載體，然后通過PCR擴增的方法得到PCR擴增片段，gga-PDPK1引物序列： gga-PDPK1-F：5′-AGATCGCCGTGTGACTCGAGTAACAATCAGACATGCAGTCACCTTGC-3′，gga-PDPK1-R：5′-CCCCGACTCTAGCACGCGTCCTTGACACAAGATTTGAAACTGCC-3′，其引物末端具有20個線性化載體末端的同源堿基，其中黑色下劃線部分序列為同源臂序列，未劃線部分分別為PDPK1的上游引物序列和下游引物序列，Mlu I、Xho I酶切位點為引物兩端添加同源臂的位置。PDPK1報告基因質粒及gga-miR-148a-5p mimincs序列由上海吉滿生物科技有限公司合成。

雙酶切PCR產物，2%瓊脂糖凝膠電泳純化回收;Mlu I、Xho I雙酶切PGL3-CMV-LUC-MCS空載體，產物經2%瓊脂糖凝膠電泳純化回收;采用無縫克隆的方式，根據HieffCloneTM重組反應體系，將酶切好的載體與目的片段進行連接，于50 ℃連接20 min，再取10 μl的連接產物加入制備好的DH5α感受態(tài)細胞中，置于冰上。最后再加入到含氨芐霉素或卡那霉素等的平板上，涂板后挑選若干個單菌落，進行小量搖菌培養(yǎng)，然后進行測序鑒定。

1.2.3雙熒光素酶活性檢測分別將接種構建成功的PDPK1 3′UTR報告基因載體質粒菌液移至5 ml LB培養(yǎng)液中，37 ℃搖床（220 r/min）過夜，用高純度質粒抽提試劑盒QIAprep Miniprep Handbook制備質粒。將狀態(tài)良好，處于對數生長期的空白細胞用0.25%胰酶消化，用完全培養(yǎng)基懸浮成單細胞懸液，細胞計數后，接種于24孔培養(yǎng)板中，培養(yǎng)過夜，觀察細胞生長狀態(tài)。在細胞覆蓋率70%左右時，進行轉染試驗，轉染2 h前將培養(yǎng)基換為新鮮的培養(yǎng)基，分別為miR-148a-5p mimics+PDPK1 WT1+TK、miR-148a-5p mimics+PDPK1 WT2+TK、miR-148a-5p mimics+PDPK1 WT3+TK、miR-148a-5p mimics+UTRNC+TK、miR NC+ PDPK1 WT1+TK、miRNC+PDPK1 WT2+TK、miRNC+PDPK1 WT3+TK、miRNC+UTRNC+TK，轉染48 h后，從培養(yǎng)箱中取靶細胞裂解、離心，收取上清液，然后根據報告基因檢測試劑盒說明書操作進行檢測。

1.2.4統(tǒng)計學分析所有試驗結果均采用 SPSS 18.0軟件進行統(tǒng)計，結果用均數±標準差表示，組間比較采用t檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2結果

2.1gga-miR-148a-5p與PDPK1 3′UTR互補結合位點預測

通過生物信息學軟件Targetscan、miRbase篩選得分較高，且交集較多的靶基因，結果發(fā)現gga-miR-148a-5p與PDPK1 3′UTR存在互補結合位點（圖1）。

2.2重組載體質粒的測序結果

重組載體質粒基因測序選用sanger測序法，其中PGL3-CMV-LUC-gga-PDPK1 3′UTR（gga-miR-148a-5p）WT1、PGL3-CMV-LUC-gga-PDPK1 3′UTR（gga-miR-148a-5p）WT2采用sanger反向測序法，PGL3-CMV-LUC-gga-PDPK1 3′UTR（gga-miR-148a-5p）WT3采用sanger正向測序法。3種PGL3-CMV-LUC-gga-PDPK1 3′UTR（gga-miR-148a-5p）WT陽性重組克隆測序分別如圖2、圖3、圖4，經過比對，重組克隆中插入片段序列與目的片段序列完全一致，因此載體構建成功。

2.3雙熒光素酶活性

轉染48 h 后，在infinite M1000熒光檢測儀上檢測螢火蟲與海腎熒光素酶值，并計算二者相對熒光素酶活性（△Ct），3次獨立重復試驗結果顯示，每個樣品的螢火蟲及海腎的熒光素酶值均較高且表達穩(wěn)定。在轉染重組載體質粒PGL3-CMV-LUC-gga-PDPK1 3′UTR WT的試驗中，與 gga-miR-148a-5p NC組相比較，gga-miR-148a-5p組的熒光素酶活性和miR-148a-5p mimics組熒光素酶活性均顯著下降，差異顯著;轉染空白載體質粒的試驗中，2組熒光素酶活性無顯著差異（圖5）。

3討論

截至目前，已經報道了994個與雞有關的成熟miRNA，但尚不清楚miRNA參與ALV-J誘導腫瘤發(fā)生的機制以及參與宿主抗ALV-J應答調節(jié)的具體miRNA。ALV-J在受感染的雞中能引發(fā)腫瘤性疾病，從而導致其死亡，同時引起非腫瘤性疾病，即由免疫抑制引起的繼發(fā)感染[1]，使得病雞出現身體消瘦、耐受性病毒血癥和免疫抑制等癥狀[13-14]。ALV-J影響了全球家禽業(yè)，它已在美國[15]、中東[16]、澳大利亞[17]等地被發(fā)現，并造成了巨大的經濟損失。

miRNA作為重要的基因表達和蛋白質翻譯過程中的調控因子，在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中，miRNA通過結合其靶基因3′UTR區(qū)域沉默其靶基因的功能，從而發(fā)揮其調控樞紐的作用[18]。在本試驗前期階段，我們利用生物信息學技術，在miRNA靶基因預測網站（miRDB，TargetScan）發(fā)現，PDPK1基因3′UTR的第42、2 455、3 731、3 907、4 110堿基序列位置可能和gga-miR-148a-5p互補，所以據此推測，PDPK1可能是在癌癥發(fā)生、發(fā)展過程中gga-miR-148a-5p的一個潛在靶基因，gga-miR-148a-5p調控PDPK1基因mRNA表達。所以為了進一步研究gga-miR-148a-5p和PDPK1之間的關系，本試驗采用雙熒光素酶報告基因檢測系統(tǒng)，驗證二者之間是否存在靶標關系。我們將含有gga-miR-148a-5p結合靶位點3′UTR的PDPK1基因目的片段克隆插入PGL3-CMV-LUC-MCS雙熒光素酶報告載體中的Xho I，Mlu I的酶切位點，將構建成功的質粒經Xho I，Mlu I酶切，并經過測序后證明質粒構建成功。試驗結果表明，gga-miR-148a-5p能夠顯著抑制熒光素酶的表達，gga-miR-148a-5p 能夠直接作用于PDPK1的3′UTR區(qū)并對其產生負性調控作用，PDPK1是gga-miR-148a-5p的靶基因。

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（責任編輯：陳海霞）