劉 明，陶思行，譚九峰，陳曉亮，晉學(xué)飛，王傳芳，那萬(wàn)里

(1.四平市中心人民醫(yī)院，吉林 四平136000；2.吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院；3.榆樹(shù)市中醫(yī)院)

前列腺癌是男性常見(jiàn)惡性腫瘤之一，其發(fā)病率呈逐年上升趨勢(shì)。前列腺癌早期癥狀不明顯，大多數(shù)患者在初診時(shí)已為中晚期，預(yù)后較差[1]。因此，提高前列腺癌的臨床診療水平是十分必要的。長(zhǎng)鏈非編碼RNA(lncRNA)是一組轉(zhuǎn)錄本長(zhǎng)度超過(guò)200nt、且不編碼蛋白的RNA，其可在轉(zhuǎn)錄水平及轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控下游靶基因表達(dá)，并作為促癌基因或抑癌基因參與惡性腫瘤的發(fā)生與發(fā)展[2,3]。腦胞質(zhì)RNA1(BCYRN1)是由人類(lèi)染色體2p16編碼的一類(lèi)lncRNA[4]。研究證實(shí)，BCYRN1在非小細(xì)胞肺癌[5]、宮頸癌[6]等惡性腫瘤中表達(dá)失調(diào)，且其表達(dá)異常與腫瘤進(jìn)展密切相關(guān)。但BCYRN1與前列腺癌的關(guān)系尚未明確。本研究旨在觀察BCYRN1在前列腺癌中的表達(dá)及其與臨床病理特征的相關(guān)性，并通過(guò)干預(yù)BCYRN1表達(dá)研究其對(duì)前列腺癌細(xì)胞凋亡的影響，以期為前列腺癌的臨床診療提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 組織標(biāo)本采集選取2018年1月至2018年12月我院行手術(shù)切除的47例前列腺癌患者癌組織樣本和癌旁組織樣本(距離腫瘤組織邊緣>5 cm)，患者術(shù)前均未接受放化療治療。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理學(xué)委員會(huì)審批通過(guò)，患者均簽署知情同意書(shū)。

1.2 細(xì)胞系和主要試劑人前列腺正常肌成纖維基質(zhì)細(xì)胞WPMY-1、前列腺癌細(xì)胞株P(guān)C-3、22RV1、DU-145、LNcap購(gòu)于美國(guó)ATCC；DMEM培養(yǎng)基、PBS緩沖液、胰蛋白酶、胎牛血清購(gòu)于Hyclone公司；RT-PCR試劑、Bax單抗、Bcl-2單抗、Akt單抗購(gòu)于大連Takara公司；Western blot試劑盒購(gòu)于南京建成生物有限公司；LipofectamineTM2000脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑購(gòu)于Invitrogen公司；CCK8試劑盒購(gòu)于碧云天試劑有限公司。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染常規(guī)復(fù)蘇細(xì)胞，用含有10%胎牛血清+1%雙抗的DMEM培養(yǎng)液重懸浮細(xì)胞，并置于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每天換液1次。收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，接種于細(xì)胞培養(yǎng)板中，細(xì)胞濃度為2×106cells/孔，采用LipofectamineTM2000用siRNA-NC、siRNA-BCYRN1對(duì)細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染，細(xì)胞置于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。

1.4 qRT-PCR檢測(cè)BCYRN1表達(dá)參照Trizol試劑盒說(shuō)明書(shū)提取組織/細(xì)胞中總RNA，利用反轉(zhuǎn)錄試劑盒逆轉(zhuǎn)錄總RNA至cDNA，以此cDNA為模板并根據(jù)SYBR Premix ExTaqTM說(shuō)明書(shū)行qRT-PCR，用公式2-△△CT計(jì)算BCYRN1的相對(duì)表達(dá)。BCYRN1引物序列：上游5’-CTGGGCAATA-TAGCGAGAC-3’，下游5’-TGCTTTGAGGGAA-GTTACG-3’；GAPDH引物序列：上游5’-CGCTC-TCTGCTCCTCCTGTTC-3’，下游5’-ATCCGTTGACTCCGACCTTCAC-3’。

1.5 BCYRN1表達(dá)與前列腺癌患者臨床病理的關(guān)系根據(jù)BCYRN1的相對(duì)表達(dá)，將前列腺癌患者分為高表達(dá)組和低表達(dá)組，并分析BCYRN1表達(dá)與患者年齡、腫瘤大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、病理分級(jí)、T分期及Gleason評(píng)分的關(guān)系。

1.6 CCK-8檢測(cè)細(xì)胞增殖收集轉(zhuǎn)染后細(xì)胞，并接種于96孔板中，細(xì)胞終濃度為2×106cells/孔，分別于培養(yǎng)24 h、48 h、72 h、96 h時(shí)，棄去細(xì)胞培養(yǎng)液，每孔加入10 μl的CCK-8溶液，孵育10 min，用全自動(dòng)酶標(biāo)儀測(cè)定波長(zhǎng)OD450 nm處光密度值。

1.7 流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡收集轉(zhuǎn)染后細(xì)胞，將細(xì)胞置于37℃、5% CO2條件中繼續(xù)培養(yǎng)48 h，采用凋亡試劑盒(Annexin-V/PI)進(jìn)行避光染色，1 h后上流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況。細(xì)胞凋亡率=[(右上象限細(xì)胞+右下象限細(xì)胞)/總細(xì)胞數(shù)]×100%。

1.8 Western blot法檢測(cè)凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)收集轉(zhuǎn)染后細(xì)胞，蛋白提取試劑盒提取細(xì)胞蛋白，BCA蛋白定量試劑盒檢測(cè)樣品蛋白濃度，取200 μl樣品行SDS-PAGE凝膠電泳，轉(zhuǎn)膜，4℃封閉4 h，后依次加入1∶2000濃度的Bcl-2、Bax、Akt、p-Akt 一抗(兔抗人Bcl-2和兔抗人Bax)、1∶500濃度HRP標(biāo)記的二抗，按ECL試劑盒說(shuō)明書(shū)行電化學(xué)發(fā)光檢測(cè)。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS20.0分析數(shù)據(jù)，計(jì)量資料用均值±標(biāo)準(zhǔn)差(Mean±SD)表示，多組間比較用單因素方差檢驗(yàn)，兩兩間比較用LSD-t檢驗(yàn)，P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 BCYRN1在前列腺癌組織及細(xì)胞中的表達(dá)分析

BCYRN1在前列腺癌組織中的表達(dá)明顯高于癌旁正常組織(P<0.05)(見(jiàn)圖1A)；與WPMY-1細(xì)胞比較，BCYRN1在PC-3、22RV1、DU-145、LNcap細(xì)胞中的表達(dá)明顯增高(P<0.05)，其中以PC-3、22RV1細(xì)胞最高(見(jiàn)圖1B)。

2.2 BCYRN1表達(dá)與前列腺癌患者臨床病理的關(guān)系

BCYRN1高表達(dá)與前列腺癌患者病理分級(jí)、T分期及Gleason評(píng)分有關(guān)(P<0.05)，與患者年齡、腫瘤大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移無(wú)關(guān)(P>0.05)(見(jiàn)表1)。

表1 BCYRN1表達(dá)與前列腺癌患者臨床病理的關(guān)系

2.3 轉(zhuǎn)染siRNA-BCYRN1對(duì)前列腺癌細(xì)胞中BCYRN1表達(dá)的影響

選取BCYRN1表達(dá)水平最高的兩株前列腺癌細(xì)胞PC-3、22RV1為對(duì)象，并分別轉(zhuǎn)染siRNA-NC和siRNA-BCYRN1，采用qRT-PCR檢測(cè)細(xì)胞中BCYRN1表達(dá)。與轉(zhuǎn)染siRNA-NC相比較，轉(zhuǎn)染siRNA-BCYRN1后細(xì)胞中BCYRN1表達(dá)顯著降低(P<0.05)(見(jiàn)圖2)。

圖1A 前列腺癌組織及癌旁組織中BCYRN1表達(dá)水平比較 圖1B WPMY-1及前列腺癌細(xì)胞中BCYRN1表達(dá)水平比較 圖2 轉(zhuǎn)染siRNA-BCYRN1對(duì)前列腺癌細(xì)胞中BCYRN1表達(dá)的影響

2.4 轉(zhuǎn)染siRNA-BCYRN1對(duì)前列腺癌細(xì)胞增殖的影響

CCK8結(jié)果顯示：與轉(zhuǎn)染siRNA-NC相比較，轉(zhuǎn)染siRNA-BCYRN1后PC-3、22RV1細(xì)胞增殖活性均顯著降低(P<0.05)(見(jiàn)圖3A、3B)。

2.5 轉(zhuǎn)染siRNA-BCYRN1對(duì)前列腺癌細(xì)胞凋亡的影響

流式結(jié)果顯示：與轉(zhuǎn)染siRNA-NC相比較，轉(zhuǎn)染siRNA-BCYRN1后PC-3、22RV1細(xì)胞凋亡率均顯著增高(P<0.05)(見(jiàn)圖4)。

2.6 轉(zhuǎn)染siRNA-BCYRN1對(duì)凋亡相關(guān)蛋白的影響

Western blot結(jié)果顯示：與轉(zhuǎn)染siRNA-NC相比較，轉(zhuǎn)染siRNA-BCYRN1后PC-3、22RV1細(xì)胞Bcl-2、p-Akt表達(dá)顯著減少(P<0.05)，Bax表達(dá)顯著增高(P<0.05)，而Akt表達(dá)無(wú)明顯變化(P>0.05)(見(jiàn)圖5)。

圖4 轉(zhuǎn)染siRNA-BCYRN1對(duì)PC-3、22RV1細(xì)胞凋亡的影響

3 討論

BCYRN1在多種惡性腫瘤中存在異常表達(dá)。Ren等[7]研究指出，BCYRN1在胃癌組織及胃癌細(xì)胞中均呈現(xiàn)高表達(dá)，且其表達(dá)與胃癌患者腫瘤大小及TNM分期呈正相關(guān)；沉默BCYRN1表達(dá)可明顯抑制胃癌細(xì)胞體外增殖、遷移，并可誘導(dǎo)細(xì)胞G1/G0期阻滯，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。Booy等[8]研究表明，在乳腺癌細(xì)胞和肺癌細(xì)胞中均可見(jiàn)BCYRN1過(guò)表達(dá)，而B(niǎo)CYRN1表達(dá)下調(diào)可抑制癌細(xì)胞增殖，并誘導(dǎo)其凋亡。本研究中，我們通過(guò)觀察前列腺癌組織和細(xì)胞系中BCYRN1表達(dá)變化發(fā)現(xiàn)，BCYRN1在前列腺癌組織中的表達(dá)明顯高于癌旁正常組織(P<0.05)，且前列腺癌細(xì)胞中BCYRN1表達(dá)均明顯高于前列腺正常肌成纖維基質(zhì)細(xì)胞(P<0.05)。進(jìn)一步通過(guò)分析BCYRN1表達(dá)與前列腺癌臨床病理特征的相關(guān)性發(fā)現(xiàn)，BCYRN1高表達(dá)與前列腺癌患者病理分級(jí)、T分期及Gleason評(píng)分有關(guān)(P<0.05)，但與患者年齡、腫瘤大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移無(wú)關(guān)(P>0.05)。上述結(jié)果表明，BCYRN1在包括前列腺癌在內(nèi)的多種惡性腫瘤中呈高表達(dá)，其表達(dá)上調(diào)可能參與了腫瘤的發(fā)生發(fā)展。

圖5 轉(zhuǎn)染siRNA-BCYRN1對(duì)PC-3、22RV1細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

之后，我們利用siRNA技術(shù)在前列腺癌細(xì)胞中實(shí)現(xiàn)了BCYRN1表達(dá)沉默，并以此分析BCYRN1在前列腺癌中的作用。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：與轉(zhuǎn)染siRNA-NC相比較，轉(zhuǎn)染siRNA- BCYRN1可使得前列腺癌細(xì)胞中BCYRN1表達(dá)明顯下調(diào)，同時(shí)顯著抑制細(xì)胞增殖活性(P<0.05)，表明BCYRN1高表達(dá)是促使前列腺癌細(xì)胞惡性增殖主要原因之一。類(lèi)似現(xiàn)象，也已在肺癌[9]、乳腺癌[10]中得到證實(shí)。此外，轉(zhuǎn)染siRNA- BCYRN1前列腺癌細(xì)胞凋亡率明顯增高，與轉(zhuǎn)染siRNA-NC相比差異顯著(P<0.05)，這表明BCYRN1可能是作為促癌基因參與前列腺癌的致瘤過(guò)程，并可調(diào)控前列腺癌細(xì)胞凋亡。

Akt信號(hào)通路位于細(xì)胞凋亡網(wǎng)絡(luò)的上游，其過(guò)度激活是癌細(xì)胞得以存活的重要機(jī)制[11，12]。本研究中，我們檢測(cè)了BCYRN1沉默后前列腺癌細(xì)胞中Akt的磷酸化水平，結(jié)果顯示：轉(zhuǎn)染siRNA- BCYRN1能夠明顯抑制前列腺癌細(xì)胞的Akt磷酸化，提示BCYRN1的促癌作用可能與調(diào)控Akt信號(hào)通路有關(guān)。Bcl-2、Bax是凋亡網(wǎng)絡(luò)中的核心蛋白，其中Bcl-2具有抑制細(xì)胞凋亡作用，而B(niǎo)ax則可促進(jìn)細(xì)胞凋亡[13，14]。當(dāng)Bcl-2過(guò)度表達(dá)或Bax表達(dá)降低，則易形成Bcl-2/Bax異二聚體，從而抑制細(xì)胞凋亡；反之，當(dāng)Bcl-2表達(dá)下調(diào)或Bax表達(dá)增高，則可形成Bax/Bax同二聚體，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡發(fā)生[12，15]。本研究結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染siRNA- BCYRN1后，隨著前列腺癌細(xì)胞中Akt磷酸化水平的降低，其Bcl-2表達(dá)也顯著減少(P<0.05)，而B(niǎo)ax表達(dá)則顯著增高(P<0.05)。這表明，BCYRN1對(duì)前列腺癌細(xì)胞凋亡的調(diào)控機(jī)制，可能與激活A(yù)kt信號(hào)通路，進(jìn)而調(diào)控Bcl-2/Bax表達(dá)有關(guān)。

綜上所述，BCYRN1在前列腺癌組織和細(xì)胞中高表達(dá)，沉默BCYRN1可抑制前列腺癌細(xì)胞增殖，并促進(jìn)細(xì)胞凋亡，其機(jī)制可能與調(diào)控Akt信號(hào)通路有關(guān)。