劉 敩，王 晶，張 輝，方宏艷

(吉林大學(xué)第二醫(yī)院，吉林 長春130041)

顯著性地區(qū)差異是喉癌的流行病學(xué)特征,我國東北地區(qū)為喉癌高發(fā)區(qū)，并且呈逐年升高趨勢[1]。目前喉癌治療主要以手術(shù)治療為主，同時(shí)輔以化療放療，內(nèi)分泌治療等。研究發(fā)現(xiàn)，天然植物中的生物堿具有明顯的抗腫瘤功效[2]。目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的抗腫瘤生物堿包括小檗堿、長春新堿、喜樹堿、苦參堿、紫杉醇等生物堿，本研究以人喉癌細(xì)胞株(Hep-2細(xì)胞)為靶系統(tǒng)體外觀察苦參堿對(duì)Hep-2細(xì)胞增殖周期及誘導(dǎo)凋亡的影響。

1 材料與方法

1.1 材料人喉癌細(xì)胞株由吉林省腫瘤研究所饋贈(zèng)。RPMI1640培養(yǎng)基，四甲基偶氮唑藍(lán)(MTT試劑)購自美國sigma公司，苦參生物堿注射液購自上海伊幫醫(yī)藥信息有限公司。

1.2 方法MTT比色法檢測Hep-2細(xì)胞增殖抑制率，流式細(xì)胞術(shù)檢測Hep-2細(xì)胞周期進(jìn)程變化，參照文獻(xiàn)[3]進(jìn)行?？鄥A誘導(dǎo)Hep-2細(xì)胞凋亡率檢測采用吖啶橙吸收法。

2 結(jié)果

2.1不同濃度苦參堿對(duì)Hep-2細(xì)胞增殖抑制率具有一定的劑量依賴性，組間比較差異顯著，見表1。

表1 不同濃度苦參堿制劑對(duì)Hep-2細(xì)胞增殖抑制率

2.2不同濃度苦參堿制劑對(duì)Hep-2細(xì)胞周期進(jìn)程影響，可見G0/G1期細(xì)胞增多，S期細(xì)胞減少，G2/M期細(xì)胞相對(duì)增多，組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見表2。

表2 不同濃度苦參堿制劑對(duì)Hep-2細(xì)胞周期進(jìn)程影響

2.3 熒光染色結(jié)果不同濃度苦參堿制劑對(duì)Hep-2細(xì)胞均有促凋亡作用，4 mg/ml、8 mg/ml苦參堿制劑作用于Hep-2細(xì)胞凋亡率升高分別為(29.4±4.3)%和(42.8±4.7)%，見圖1-3。

圖1 0 mg/ml 苦參堿誘導(dǎo)Hep-2細(xì)胞熒光染色圖400× 圖2 4 mg/ml 苦參堿誘導(dǎo)Hep-2細(xì)胞熒光染色圖100× 圖3 8 mg/ml 苦參堿誘導(dǎo)Hep-2細(xì)胞熒光染色圖100×

3 討論

苦參堿作為中藥苦參的萃取物，臨床上用于殺蟲、抗炎、抗過敏等常用藥。近年來研究表明，苦參堿具有抗腫瘤、抗新生血管生成等特殊作用。體外實(shí)驗(yàn)證明，苦參堿對(duì)肝癌、胃癌、肺癌等腫瘤細(xì)胞均有明顯的增殖抑制及誘導(dǎo)凋亡作用[3]，且對(duì)正常細(xì)胞無影響。本研究以Hep-2細(xì)胞為靶點(diǎn)。觀察不同濃度苦參堿對(duì)其生物學(xué)作用機(jī)制，結(jié)果表明，MTT法檢測不同濃度苦參堿制劑對(duì)Hep-2細(xì)胞的增殖抑制率，0 mg/ml、2 mg/ml、4 mg/ml、8 mg/ml組分別為2.1%、18.1%、26.3%和44.9%，與對(duì)照組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，且苦參堿對(duì)人Hep-2細(xì)胞的增殖抑制作用具有一定的劑量依賴性。

流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示，不同濃度的苦參堿制劑作用Hep-2細(xì)胞24小時(shí)后均能顯著提高G0/G1期細(xì)胞比例。而S期細(xì)胞比例減少，從而使G2/M期細(xì)胞相對(duì)增多，細(xì)胞周期間比例失衡。G0/G1期細(xì)胞阻滯不能順利進(jìn)入S期，故S期細(xì)胞減少。同時(shí)G0/G1期細(xì)胞也是各種化療藥物作用的敏感點(diǎn)[4]，G2/M期細(xì)胞增多是細(xì)胞損傷的普遍反應(yīng)，G2/M期也是細(xì)胞進(jìn)入有絲分裂前最后一道關(guān)卡[5]，臨床上多種治療手段都會(huì)使腫瘤細(xì)胞具有選擇性的停滯于該期。此外，本研究應(yīng)用免疫熒光技術(shù)，對(duì)不同濃度的苦參堿制劑誘導(dǎo)Hep-2細(xì)胞凋亡機(jī)制的探討，結(jié)果表明，BB(溴化乙啶)為啡啶類染料可嵌入多核苷酸結(jié)構(gòu)，活細(xì)胞膜可排斥BB穿透，而凋亡細(xì)胞和死亡細(xì)胞極易穿透，故凋亡細(xì)胞被染成黃色。死亡細(xì)胞則呈均勻紅色，而AO(吖啶橙)，可穿透活細(xì)胞膜，細(xì)胞被染成綠色，通過熒光顯微鏡極易區(qū)別。

綜上所述，苦參生物堿抗腫瘤機(jī)制與干擾腫瘤細(xì)胞周期進(jìn)程，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，抑制腫瘤新生血管生成和多藥耐藥等有關(guān)。