劉長路 馬麗波 劉曉民 黃健

內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院，內(nèi)蒙呼和浩特010030

隨著經(jīng)濟(jì)發(fā)展、科技進(jìn)步和人民生活水平的不斷提高，我國人口老齡化、勞動(dòng)強(qiáng)度及飲食結(jié)構(gòu)的改變?nèi)找婷黠@，糖尿病發(fā)病率逐年上升，糖尿病患者骨折后出現(xiàn)骨延遲愈合或骨不連顯著增多，治療和康復(fù)比較困難，致殘、致死率極高，影響人們的生活質(zhì)量。不僅增加醫(yī)療支出，更給患者家庭和社會(huì)造成了沉重的負(fù)擔(dān)［1－3］。尋找治療糖尿病骨折延遲愈合的有效方法意義重大。骨折后在神經(jīng)體液調(diào)節(jié)下成骨細(xì)胞被激活，激活后的成骨細(xì)胞在骨轉(zhuǎn)化代謝過程中，通常會(huì)產(chǎn)生一些代謝產(chǎn)物－成骨分化標(biāo)志物，臨床上常以檢測ALP、RUNX2、OCN和OPN作為反映成骨細(xì)胞功能的指標(biāo)［4］。

白血病抑制因子(leukemia inhibitory factor，LIF)屬于白介素 6(interleukin－6，IL－6)家族中的多向性細(xì)胞因子，在多種組織中廣泛表達(dá)，這個(gè)家族多數(shù)成員可以通過激活信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子(signal transducers and activator of transcription，STAT)來影響細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)錄等活性［5］。JAK/STAT信號(hào)通路［6］通常為細(xì)胞外配體與跨膜細(xì)胞因子受體結(jié)合，激活蛋白酪氨酸激酶，活化后使受體發(fā)生磷酸化，STAT可以識(shí)別磷酸化的受體，然后STAT亦發(fā)生磷酸化，磷酸化后形成二聚體進(jìn)入胞核，成為有活性的轉(zhuǎn)錄因子，進(jìn)而影響相關(guān)基因的表達(dá)。細(xì)胞因子信號(hào)傳導(dǎo)抑制蛋白(suppressors of cytokine signaling，SOCS)［7］是新近發(fā)現(xiàn)的一類細(xì)胞因子信號(hào)傳導(dǎo)過程中的負(fù)性調(diào)控因子，SOCS的特點(diǎn)是STAT信號(hào)通路可以激活前者的基因表達(dá)，而前者又可以抑制后者的繼續(xù)活化，從而提供一個(gè)負(fù)反饋回路，參與多種細(xì)胞因子、激素和生長因子的信號(hào)調(diào)節(jié)過程。本研究將探討STAT3/SOCS3信號(hào)通路在LIF介導(dǎo)的高糖環(huán)境下成骨細(xì)胞分化調(diào)節(jié)中的作用機(jī)制，為進(jìn)一步明確高糖導(dǎo)致的成骨障礙提供研究基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 血清標(biāo)本:本研究收集了2017年1月至2018年12月在內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院就診的2型糖尿病骨折患者和同期正常骨折患者各50例。入院后第二天晨起空腹取受試者靜脈血5 mL進(jìn)行實(shí)驗(yàn)分析，4℃放置4 h，分離出血清，離心后保存在－80℃，避免反復(fù)冷凍和解凍。本研究通過醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，所有受試者均簽署知情同意書。

1.1.2 成骨細(xì)胞:人成骨細(xì)胞MG－63購自美國細(xì)胞培養(yǎng)公司(ATCC，Manassas，VA，USA)，培養(yǎng)于 DMEM和EMEM培養(yǎng)基。培養(yǎng)基購自Gibco公司(GIBCO，Rockville，MD，USA)，添加1%非必須氨基酸(NEAA)(Sigma－Aldrich Corporation，St．Louis，MO，USA)、2 mmol/L 谷氨酰胺(Ameresco，F(xiàn)ramingham，MA，USA)和10% 胎牛血清(FBS，Invitrogen，Carlsbad，CA，USA)，于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。經(jīng)過高糖及LIF處理后的MG－63細(xì)胞用0.1%PBS沖洗，種植于含2%胎牛血清的DMEM/EMEM培養(yǎng)液中，培養(yǎng)基中添加 0、10、30、60 mg/mL 的高糖(Sigma－Aldrich，St．Louis，MO，USA)和 0、20、50、100 ng/mL 重組人 LIF 蛋白(Thermo Scientific，Rockford，IL，USA)，37 ℃、5%CO2孵育0、0.5、1、2、4、6 和12 h 后分別添加50 nmol/L的STAT3抑制劑葫蘆素水合物JSI－124(Sigma－Aldrich Corporation，St．Louis，MO，USA)到細(xì)胞上清液。

1.2 方法

1.2.1 酶聯(lián)免疫吸附法檢測細(xì)胞因子:嚴(yán)格按照ELISA 試劑盒(Thermo Scientific，Rockford，IL，USA)說明步驟檢測各種細(xì)胞因子:超敏C反應(yīng)蛋白(hsCRP)、白介素 1β(IL－1β)、白介素6(IL－6)和 LIF的水平。先用 2%BSA預(yù)沖洗(Ameresco，F(xiàn)ramingham，MA，USA)，4℃過夜，加入一系列稀釋的樣本或血清/上清液樣本室溫下孵育2 h，然后加入抗hsCRP、IL－1β、IL－6和LIF 的辣根過氧化物酶結(jié)合多克隆抗體溶液，室溫孵育40 min后，加入底物溶液室溫孵育20 min，450 nm處進(jìn)行光密度測定，每次孵育前均用PBS沖洗，一共沖洗4次。

1.2.2 實(shí)時(shí)熒光定量基因表達(dá)分析:實(shí)時(shí)熒光定量RT－PCR反應(yīng)檢測成骨細(xì)胞被干擾后ALP、RUNX2、OCN和OPN的mRNA變化。具體步驟:TRIzol提取劑(Sigma－Aldrich Corporation，St．Louis，MO，USA)提取 RNA，滴加 1 μL SUPERase·InTMRNase 抑制劑(Invitrogen，Carlsbad，CA，USA)，利用 OD260/OD280比定量檢測。每份RNA樣本的定量檢測采用One Step RT－PCR 試劑盒(Tak Kala biological，Tokyo，Japan)，首先進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄(42 ℃，5 min，5 ℃，10 s)，然后利用ABI PRISM 7900HT序列檢測系統(tǒng)(Thermo Scientific，Rockford，USA)進(jìn)行PCR反應(yīng)(95℃反應(yīng)5 s，60℃反應(yīng)20 s，40個(gè)循環(huán))，利用溶解曲線分析特異性的擴(kuò)增產(chǎn)物，利用2－ΔΔCt方法檢測 mRNA，其結(jié)果采用與磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)相對(duì)值表示，引物鏈(PCR引物由上海生工有限公司設(shè)計(jì)合成)見表1。

1.2.3 蛋白免疫印跡法檢測蛋白表達(dá):細(xì)胞核和胞漿蛋白利用NE－PERTM細(xì)胞核和細(xì)胞漿提取試劑(Sigma－Aldrich Corporation，St．Louis，MO，USA)提取，全部實(shí)驗(yàn)操作參照說明書，其定量采用BCA蛋白測定試劑盒測定(Invitrogen，Carlsbad，CA，USA)，采用12%SDS－PAGE分離相同量的(30 μg)樣本繼而將分離蛋白通過電泳轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上(Invitrogen，Carlsbad，CA，USA)，2%胎牛血清蛋白BSA(Sigma－Aldrich Corporation，St．Louis，MO，USA)溶于PBS中4℃ 過夜，封膜，室溫下孵育2 h后與特異性 STAT3/SOCS3GAPDH(Abcam biotechnology，St．Louis，Cambridge，UK)抗體結(jié)合，然后將膜用辣根過氧化物酶抗兔抗體在室溫下孵育1 h，最后用增強(qiáng)化學(xué)免疫熒光儀檢測，采用Gel－Pro分析軟件4.0分析每個(gè)目標(biāo)泳道的分光度，結(jié)果用與GAPDH相對(duì)光密度的比值表示。

表1 引物序列Table 1 The primer sequences

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

實(shí)驗(yàn)結(jié)果用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用單因素方差分析及配對(duì)資料t檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)比較，數(shù)據(jù)使用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行處理，所有實(shí)驗(yàn)均獨(dú)立操作重復(fù)3次，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 一般臨床資料

納入病例的臨床特點(diǎn)見表2。

2.2 正常人群和2型糖尿病患者血清LIF含量的比較

正常人群和2型糖尿病患者血清中超敏C－反應(yīng)蛋白(hsCRP)、白介素 1β(IL－1β)、白介素 6(IL－6)和白血病抑制因子(LIF)水平比較，糖尿病患者h(yuǎn)sCRP水平明顯高于正常組(P＜0.05，圖1 A)，IL－1β和IL－6水平也明顯升高(P＜0.05，圖1B和圖1C)，糖尿病患者 LIF水平明顯升高(P＜0.05，圖1D)，證實(shí)2型糖尿病患者中LIF及其他促炎細(xì)胞因子表達(dá)增加。

表2 兩組一般資料比較Table 2 Comparison of basic data between the two groups

圖1 ELISA檢測正常人群和2型糖尿病患者血清標(biāo)本炎性因子及LIF含量的比較Fig．1 The serum levels of inflammatory factors and LIF in normal controls and diabetes mellitus patients detected by ELISA

2.3 高糖及LIF對(duì)成骨分化標(biāo)志物表達(dá)的影響

為了探討高糖及LIF對(duì)成骨細(xì)胞分化的調(diào)節(jié)作用，用ELISA法檢測不同濃度的高糖及LIF干預(yù)MG－63后成骨分化標(biāo)志物 ALP、RUNX2、OCN和OPN的表達(dá)情況。高糖(15、50、150 mg/mL)或LIF(20、50、100 ng/mL)干預(yù) MG－63 細(xì)胞，隨著其濃度的增加，ALP的表達(dá)逐漸減低(P＜0.05)，呈劑量依賴性(圖 2 A);不同濃度葡萄糖(15、50、150 mg/mL)或 LIF(50、100 ng/mL)處理 MG－63細(xì)胞，RUNX2表達(dá)同樣下降(P＜0.05)，見圖2B;高糖和LIF處理后的MG－63細(xì)胞，OPN和OCN的表達(dá)也有明顯的下降(P＜0.05)，見圖2C和圖2D。證實(shí)了高糖或LIF對(duì)MG－63細(xì)胞成骨分化標(biāo)志物的表達(dá)有抑制作用。

圖2 ELISA法檢測高糖及LIF干預(yù)后的成骨分化相關(guān)標(biāo)志物表達(dá)水平 A:ALP;B:RUNX2;C:OCN;D:OPN。Fig．2 The expression levels of osteogenic differentiation－related markers after intervention of high glucose and LIF detected using ELISA assayA:ALP;B:RUNX2;C:OCN;D:OPN．

MG－63細(xì)胞經(jīng)0、20、50、100 ng/mL 的 LIF 處理6 h后，通過實(shí)時(shí)定量PCR檢測成骨分化標(biāo)志物ALP、OCN、OPN和 RUNX2的mRNA表達(dá)水平變化。經(jīng)50 ng/mL或100 ng/mL LIF處理后ALP的mRNA表達(dá)水平顯著降低(P＜0.05，圖 3 A)，RUNX2的mRNA水平顯著降低(P＜0.05，圖3B)，OCN和OPN的mRNA水平也顯著減低(P＜0.05，圖3C和圖3D)，均呈劑量依賴性。證實(shí)LIF抑制成骨分化標(biāo)志物mRNA的表達(dá)。

2.4 LIF干預(yù)MG－63細(xì)胞后STAT3信號(hào)通路因子表達(dá)

LIF通過激活STAT3/SOCS3信號(hào)通路介導(dǎo)成骨細(xì)胞分化，從而調(diào)節(jié)靶基因的表達(dá)，檢測STAT3/SOCS3在LIF干預(yù)后MG－63細(xì)胞中的表達(dá)情況。結(jié)果表明，LIF 干預(yù) MG－63 細(xì)胞后不同時(shí)間(0.5、1、2、4 h，圖 4 A)、不同濃度(20、50、100 ng/mL，圖 4B)STAT3的mRNA水平無顯著差異。經(jīng)50 ng/mL的LIF 干預(yù)后不同時(shí)間(2、4 h，P＜0.05，圖4 A)、不同濃度 LIF(20、50、100 ng/mL，P＜0.05，圖 4B)處理 2 h，SOCS3的mRNA水平上調(diào)。WB序列分析表明，50 ng/mL的 LIF 干預(yù) MG－63細(xì)胞 0.5、1、2、4 h后，STAT3表達(dá)升高(P＜0.05，圖 4C)，LIF 處理 1、2、4 h后SOCS3的蛋白水平也明顯上調(diào)(P＜0.05，圖4D)，P－STAT3和SOCS3的表達(dá)也被證實(shí)呈劑量依賴性(P＜0.05，圖4E)，LIF 干預(yù) MG－63細(xì)胞后 P－STAT3和SOCS3的表達(dá)增加(P＜0.05，圖4F)，證實(shí) LIF干預(yù)MG－63細(xì)胞STAT3/SOCS3信號(hào)通路被活化。

2.5 LIF介導(dǎo)成骨分化相關(guān)標(biāo)志物下調(diào)對(duì)STAT3激活的依賴性

為了更深入了解STAT3信號(hào)通路和LIF調(diào)節(jié)成骨細(xì)胞的關(guān)系，本次研究應(yīng)用STAT3抑制劑JSI－124抑制STAT3信號(hào)通路，觀察LIF干預(yù)MG－63細(xì)胞后成骨分化標(biāo)志物的表達(dá)情況(圖5 A)，50 nmol/L或100 nmol/L的JSI－124顯著減少P－STAT3的表達(dá)，STAT3的mRNA和蛋白水平未見明顯調(diào)節(jié)變化，經(jīng)過JSI－124處理后SOCS3表達(dá)也明顯下調(diào)(圖5B)，經(jīng)過50 nmol/L、100 nmol/L的 JSI－124干預(yù)及 50 ng/mL的LIF處理后，MG－63細(xì)胞的成骨分化標(biāo)志物 ALP(圖5C)、RUNX2(圖5D)、OCN(圖5E)的mRNA水平較前有顯著變化(P＜0.05)。證實(shí)LIF介導(dǎo)的成骨分化標(biāo)志物和STAT3活化有顯著聯(lián)系。

圖3 MG－63細(xì)胞經(jīng)不同濃度的LIF處理6 h后，實(shí)時(shí)定量PCR檢測成骨分化標(biāo)志物表達(dá)水平Fig．3 After treated with LIF of different concentrations for 6 hours，the levels of osteoblast differentiation markers in MG－63 cells were detected by Real－time PCR

圖4 LIF干預(yù)MG－63細(xì)胞STAT3和SOCS3的mRNA水平隨著不同時(shí)間和濃度的變化Fig．4 The mRNA levels of STAT3 and SOCS3 in MG－63 cells treated by LIF changed with time and different concentration

圖5 JSI－124對(duì)LIF干預(yù)MG－63細(xì)胞成骨分化標(biāo)志物水平的影響Fig．5 Study on the effect of JSI－124 on the levels of osteoblast differentiation markers in MG－63 cells treated with LIF

3 討論

成骨細(xì)胞成骨受多種內(nèi)在和外在因素共同影響［8］，外在因素主要為成骨細(xì)胞周圍的血供、炎癥及骨折斷端的固定等，而內(nèi)在的因素主要是指成骨細(xì)胞內(nèi)在細(xì)胞因子的影響。為了進(jìn)一步研究高糖和LIF對(duì)于成骨細(xì)胞分化作用的影響，本研究利用酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)和RT－PCR實(shí)驗(yàn)分別檢測了在不同濃度的葡萄糖和LIF干擾下成骨細(xì)胞成骨分化標(biāo)志物的表達(dá)。其中酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，隨著葡萄糖和LIF濃度的升高，成骨分化標(biāo)志物ALP、RUNX2、OCN和OPN的表達(dá)水平逐漸降低，說明葡萄糖和LIF可以抑制成骨細(xì)胞的成骨作用。利用RT－PCR方法檢測不同濃度的葡萄糖和LIF對(duì)成骨細(xì)胞干擾后其成骨分化標(biāo)志物mRNA水平的變化時(shí)，發(fā)現(xiàn)ALP、RUNX2、OCN和OPN的mRNA水平也逐漸降低，進(jìn)一步證實(shí)葡萄糖和LIF均可抑制成骨細(xì)胞的成骨作用，證實(shí)了LIF可能是葡萄糖抑制成骨細(xì)胞成骨的關(guān)鍵信號(hào)因子，但通過何種途徑發(fā)揮作用尚不清楚。

STAT3/SOCS3通路是否在LIF誘導(dǎo)成骨細(xì)胞中發(fā)揮作用尚不清楚，已有研究［9］表明LIF具有介導(dǎo)多種信號(hào)通路的作用。在骨代謝、骨重建等方面也有作用，在敲除LIF的小鼠模型中發(fā)現(xiàn)了骨分化和重塑的途徑［10］。STAT3/SOCS3信號(hào)通路參與多種細(xì)胞的分化過程，SOCS3的缺失可能影響多種干細(xì)胞的分化［11］，其主要機(jī)制是細(xì)胞外信號(hào)與細(xì)胞膜上的受體結(jié)合，結(jié)合后傳遞到細(xì)胞漿內(nèi)，與STAT蛋白結(jié)合磷酸化后，活化的STAT形成二聚體，向細(xì)胞核移動(dòng)激活炎癥介質(zhì)的產(chǎn)生。SOCS的特點(diǎn)是STAT信號(hào)通路可以激活前者的基因表達(dá)，而前者又可以抑制后者的繼續(xù)活化，是一對(duì)負(fù)反饋的調(diào)節(jié)通路［12］。本研究證實(shí)高濃度的LIF可以使成骨細(xì)胞STAT3/SOCS3的含量升高，加入抑制STAT的抑制劑JAI－124后觀察成骨作用的影響，發(fā)現(xiàn)JAI－124和LIF共同干擾成骨細(xì)胞后，成骨細(xì)胞P－STAT及SOCS3下降，說明JAI－124對(duì)STAT/SOCS3分子通路具有抑制作用，同時(shí)用RT－PCR的方法分別檢測的成骨分化標(biāo)志物ALP、RUNX2、OCN及OPN的mRNA的變化，隨著JAI－124和LIF濃度的升高，成骨分化標(biāo)志物ALP、RUNX2、OCN及OPN的mRNA顯著性升高，因此認(rèn)為STAT/SOCS3信號(hào)通路是LIF發(fā)揮抑制成骨細(xì)胞成骨作用的關(guān)鍵信號(hào)通路，通過JAI－124抑制STAT3/SOCS3，可以降低或減輕LIF抑制成骨細(xì)胞成骨的作用。本研究發(fā)現(xiàn)糖尿病患者中炎性因子上調(diào)表達(dá)的同時(shí)伴隨著成骨分化標(biāo)志物的降低，影響骨折的愈合，干擾STAT3/SOCS3信號(hào)通路即可抑制LIF干預(yù)成骨細(xì)胞的成骨作用。

4 結(jié)論

本研究探討了高糖對(duì)LIF/STAT3/SOCS3信號(hào)通路的作用，分析了LIF對(duì)成骨細(xì)胞分化的影響，研究結(jié)果提示LIF在成骨細(xì)胞分化和高糖誘導(dǎo)骨折延遲愈合中起到關(guān)鍵作用。本次研究最先發(fā)現(xiàn)了高糖通過調(diào)節(jié)LIF活化STAT3/SOCS3信號(hào)通路影響成骨細(xì)胞分化相關(guān)標(biāo)志物相關(guān)因子的表達(dá)，揭示了STAT3/SOCS3信號(hào)通路參與高糖環(huán)境下LIF介導(dǎo)成骨細(xì)胞分化的作用。通過對(duì)高血糖與LIF/STAT3/SOCS3信號(hào)通路相關(guān)分子水平表達(dá)的研究，為2型糖尿病患者骨折延遲愈合的藥物治療提供新的作用靶點(diǎn)。