朱麗璇 崔玥 羅靜

云南省第一人民醫(yī)院疼痛科，云南昆明650032

骨質疏松癥是一種代謝性骨病，其特征在于骨量和密度的降低，主要致病原因是骨生成和骨吸收之間的動態(tài)平衡被破壞［1－2］，因此骨質疏松癥患者發(fā)生脆性骨折的幾率會大大增加［3－4］，尤其是絕經(jīng)后婦女［5－6］。目前國內(nèi)采用锝［99Tc］亞甲基二膦酸鹽(99Tc－MDP)來治療骨質疏松癥，它是我國自主研發(fā)治療類風濕關節(jié)炎等疾病的一種藥物，可抑制人破骨細胞生成并通過改善松質骨和皮質骨以及增加外在骨硬度來發(fā)揮抗骨質疏松作用［7－8］。有研究［9］報道，miR－338－3p調(diào)節(jié)小鼠骨髓基質干細胞的成骨分化;miR－338－3p通過靶向核因子κB受體活化因子配體(receptor activator of nuclear factor－κB ligand，RANKL)抑制糖皮質激素誘導的骨質疏松［10］。而RANKL不僅可以誘導破骨細胞分化，而且在骨質疏松患者中高表達［11］。但是，99Tc－MDP通過miR－338－3p靶向RANKL緩解骨質疏松尚未有研究報道。因此，本研究旨在探究其中可能存在的分子機制。

1 材料和方法

1.1 材料

在手術中抽取本院收治的骨質疏松患者股骨上端液態(tài)的紅骨髓，用D－Hanker’s液等倍稀釋，離心獲得骨髓單個核細胞，用25－(OH)2D3誘導成破骨細胞(osteoporosis－derived osteoclast，OC);99Tc－MDP購于成都云克藥業(yè)有限責任公司;TRIZOL以及蛋白提取試劑盒購于賽默飛公司;反轉錄試劑盒以及熒光定量PCR試劑盒購于Takara公司;免疫印跡一抗(GAPDH和RANKL鼠抗)和二抗(羊抗鼠)購于CST公司;SDS－PAGE凝膠制備試劑盒購于貝博生物;DMEM、胎牛血清以及青鏈霉素購于Gibco公司;CCK－8試劑盒購于碧云天生物科技有限公司;miR－338－3p mimics/inhibitor以及 sh－RANKL 購于百奧邁科生物技術有限公司;Lipofectamine 2000轉染試劑盒購于上海翊圣生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)和轉染:OC細胞在含有10%胎牛血清、100 U/mL青鏈霉素、1×10－7mol/L地塞米松和 1×10－8mol/L 25－(OH)2D3的 DMEM 培養(yǎng)基中，并置于條件為37℃、5%CO2細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1～3周。接種適量細胞于24孔板中，當細胞密度達到50%～60%時進行細胞轉染。嚴格按照Lipofectamine 2000試劑盒說明書操作破骨細胞轉染，對照組轉染空載體，過表達組將 miR－338－3p mimics轉染到破骨細胞中。轉染細胞在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)，6～8 h后換液，并加入完全培養(yǎng)基。培養(yǎng)72 h后檢測轉染效率，實驗重復3次。

1.2.299Tc－MDP制備:按照試劑商提供的操作手冊將試劑A(共有5 mL，含0.05 g99Tc)和試劑B(含5 mg MDP以及0.5 mg氯化亞錫)室溫混合5 min，最后調(diào)整原液濃度為1 μg/mL MDP。

1.2.3 qRT－PCR 檢測 miR－338－3p、CD51、以及MMP－9表達:收集對數(shù)期轉染的細胞，用TRIZOL法進行總RNA提取，并用Nanodrop定性以及定量。按照反轉錄試劑盒將RNA反轉成cDNA，反應條件為37℃，15 min;85℃，5 s。隨后按照熒光定量PCR試劑盒說明檢測miR－338－3p以及CD51和MMP－9 mRNA表達，以GAPDH或U6作為參照，引物由擎科生物合成，序列如表1所示。數(shù)據(jù)由2－ΔΔCt方法處理，實驗重復3次。

表1 引物序列Table 1 Primer sequence

1.2.4 CCK－8檢測OC細胞增殖:收集對數(shù)期OC細胞，接種至96孔板中，每孔加入100 μL細胞懸液，37℃、5%CO2預培養(yǎng)24 h。次日，向每孔加入10 μL CCK－8 溶液，培養(yǎng)箱孵育 2 h。隨后每 0、24、48、72、96 h檢測細胞在450 nm處吸光值，實驗重復3次。

1.2.5 Western blotting檢測RANKL表達:嚴格按照蛋白提取試劑盒說明提取細胞總蛋白，BCA定量。取等量蛋白加入上樣緩沖液95℃加入10 min。隨后用10%SDS－PAGE分離蛋白，并轉至PVDF膜，5%脫脂奶粉室溫封閉1 h。去除脫脂奶粉，TBST清洗 3次，加入稀釋的一抗(RANKL，1∶1 000)4℃搖床孵育過夜?；厥找豢梗肨BST清洗PVDF膜3次，加入二抗，室溫搖床孵育2 h。最后回收二抗，TBST清洗3次，加入化學發(fā)光顯色液，凝膠成像顯影，分析條帶灰度值。實驗重復3次。

1.2.6 雙熒光素酶報告基因檢測miR－338－3p與RANKL靶向關系:通過TargetScan以及starBase數(shù)據(jù)庫查到miR－338－3p與RANKL結合的位點，用PCR擴增后連接到質粒中，構建野生型質粒。突變其結合位點，得到突變型質粒。將 miR－338－3p mimics與質粒共轉染到293T細胞中，隨后按照雙熒光素酶報告基因試劑盒說明書檢測熒光強度。實驗重復3次。

1.3 統(tǒng)計學方法

通過SPSS 20.0統(tǒng)計軟件分析實驗數(shù)據(jù)，相關實驗圖片的繪制采用Graphpad軟件繪制。

組間比較采用t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析。P＜0.05或P＜0.01表示數(shù)據(jù)差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 99Tc－MDP抑制OC細胞活性

qRT－PCR結果表明，99Tc－MDP能夠顯著下調(diào)OC細胞中破骨細胞活性標志物CD51和MMP－9的表達水平，且呈劑量依賴性(P＜0.05或P＜0.01或P＜0.001，圖 1 A);CCK－8結果表明，隨著99Tc－MDP濃度增加，OC細胞存活率逐漸降低，半抑制濃度(IC50)為 14 ng/mL(圖 1B)。因此，99Tc－MDP 可以抑制OC細胞活性以及CD51和MMP－9的分泌。

圖1 99Tc－MDP抑制OC細胞活性及CD51和MMP－9的分泌 A:qRT－PCR檢測OC細胞中CD51和MMP－9 mRNA的表達水平;B:CCK－8實驗檢測OC細胞存活率。Fig．1 99Tc－MDP inhibited the cell activity and the expression of CD51 and MMP－9 of OC cells

2.2 99Tc－MDP促進 miR－338－3p表達并抑制RANKL表達

分別在細胞培養(yǎng)基中加入0、5、14 ng/mL的99Tc－MDP，常規(guī)培養(yǎng)。qRT－PCR 結果表明，隨著99Tc－MDP濃度的增加，miR－338－3p表達水平顯著上升(P＜0.05或 P＜0.01，圖 2 A);Western blotting結果表明，RANKL表達隨著99Tc－MDP濃度升高顯著下調(diào)(P＜0.05或 P＜0.01，圖2B)。以上結果說明，99Tc－MDP 可以上調(diào) miR－338－3p，下調(diào) RANKL的表達水平。

圖2 99Tc－MDP促進miR－338－3p表達且抑制RANKL表達 A:qRT－PCR檢測OC細胞中miR－338－3p的表達水平;B:Western blotting檢測OC細胞中RANKL的表達水平。Fig．2 99Tc－MDP promoted the expression of miR－338－3p and suppressed the expression of RANKL

2.3 miR－338－3p靶向下調(diào)RANKL

通過TargetScan和starBase數(shù)據(jù)庫分析得知，RANKL是miR－338－3p潛在下游靶點，結合位點如圖3 A所示。雙熒光素酶報告基因結果表明，與對照組相比，共轉 miR－338－3p mimics+RANKL－WT顯著降低熒光素酶活性(P＜0.01，圖3B);而共轉miR－338－3p mimics+RANKL－MUT 時熒光素酶活性與對照組無明顯差異。Western blotting結果表明，與對照組相比，過表達miR－338－3p可以顯著下調(diào) RANKL 表達(P＜0.05，圖 3C)。因此，miR－338－3p可以靶向結合RANKL并下調(diào)其表達。

2.4 99Tc－MDP通過 miR－338－3p靶向下調(diào)RANKL抑制OC細胞增殖及活性

圖3 miR－338－3p靶向下調(diào)RANKL A:Targetscan生信網(wǎng)站預測miR－338－3p與RANKL的結合位點;B:雙熒光素酶報告基因系統(tǒng)驗證miR－338－3p與RANKL的靶向關系;C:Western blotting檢測OC細胞中RANKL的表達水平。Fig．3 miR－338－3p targeted RANKL and suppressed its expression

qRT－PCR結果表明，與對照組相比，培養(yǎng)基加入14 ng/mL99Tc－MDP 顯著上調(diào) miR－338－3p;99Tc－MDP+miR－338－3p inhibitor組 miR－338－3p表達顯著低于99Tc－MDP 組;而99Tc－MDP+miR－338－3p inhibitor組 miR－338－3p表達顯著低于99Tc－MDP+miR－338－3p inhibitor+sh－RANKL 組(P＜0.01，圖 4 A)。Western blotting結果表明，99Tc－MDP 組RANKL表達顯著低于對照組;99Tc－MDP+miR－338－3p inhibitor組 RANKL表達顯著高于99Tc－MDP組;99Tc－MDP+miR－338－3p inhibitor+sh－RANKL 組RANKL表達顯著低于99Tc－MDP+miR－338－3p inhibitor組(P＜0.01，圖 4B)。CCK－8結果表明，與對照組相比，加入14 ng/mL99Tc－MDP后，OC細胞增殖活力顯著降低;而99Tc－MDP+miR－338－3p inhibitor組OC細胞增殖活力顯著高于99Tc－MDP組;99Tc－MDP+miR－338－3p inhibitor+sh－RANKL 組OC細胞增殖活力顯著低于99Tc－MDP+miR－338－3p inhibitor組(P＜0.01，圖 4C)。qRT－PCR 結果表明，OC細胞活性標志物CD51以及MMP－9表達方面，99Tc－MDP 組顯著低于對照組;99Tc－MDP+miR－145 inhibitor組顯著高于99Tc－MDP 組;99Tc－MDP+miR－145 inhibitor+sh－MKK4 組顯著低于99Tc－MDP+miR－145 inhibitor組(P＜0.01，圖 4D)。因此，99Tc－MDP通過miR－338－3p靶向下調(diào)RANKL抑制OC細胞增殖及活性。

3 討論

骨質疏松癥是一種常見疾病，其特征是低骨密度和低創(chuàng)傷性骨折，主要是由于成骨細胞的骨形成超過破骨細胞的骨吸收所致［12－13］。骨質疏松癥是全球主要的公共衛(wèi)生問題之一，特別是在人口老齡化較多的國家，如中國［14］。99Tc－MDP 是中國自主研發(fā)的抗炎藥物，自1997年以來，它已被用于中國類風濕關節(jié)炎和強直性脊柱炎的安全治療［15］。已有文獻報道，99Tc－MDP可用于治療骨質疏松，但具體作用機制尚不完全明確。

microRNA是一種長度僅有20～24 bp的非編碼RNA［16］。目前發(fā)現(xiàn)有 miRNAs可能與骨質疏松癥相關，有文獻報道m(xù)iR－422a可能是骨質疏松癥的潛在生物標志物［17］;miRNA－133a通過促進破骨細胞分化參與絕經(jīng)后骨質疏松癥的調(diào)節(jié)［18］。本研究發(fā)現(xiàn)，miR－338－3p在 OC細胞中低表達，并且隨著99Tc－MDP濃度的增加，miR－338－3p表達也顯著增加。此外，在99Tc－MDP作用下，過表達miR－338－3p顯著抑制OC細胞存活，且破骨細胞活性標志物CD51以及MMP－9表達顯著下調(diào)。

MiRNA一般都是通過調(diào)控下游蛋白以參與疾病的發(fā)生發(fā)展。RANKL是腫瘤壞死因子(TNF)配體超家族的成員，由成骨細胞、成纖維細胞和活化的T細胞及B細胞表達［19］，并且RANKL可以誘導破骨細胞形成以及影響其功能［20］。此外，RANKL在破骨細胞前體細胞表面與RANK結合，導致破骨細胞前體細胞的分化和融合，并刺激成熟破骨細胞的活性［21］。有研究報道，在破骨細胞中miRNA能夠調(diào)控RANKL表達。例如，miR－302a－3p調(diào)節(jié)人下頜骨成骨細胞樣細胞中的 RANKL表達［22］;25－h(huán)ydroxycholesterol通過在miR－139－5p的轉錄中協(xié)調(diào)NFATc1和Sp1復合物來促進RANKL誘導的破骨細胞生成［23］。在骨質疏松中，miR－338－3p通過靶向RANKL抑制糖皮質激素誘導的破骨細胞生成［10］。本研究通過實驗發(fā)現(xiàn)，miR－338－3p靶向下調(diào)RANKL，并且敲降RANKL可以抑制OC細胞增殖以及活性標志物CD51以及MMP－9表達。進一步研究表明，99Tc－MDP通過miR－338－3p靶向下調(diào)RANKL抑制OC細胞增殖及活性從而緩解骨質疏松發(fā)生。

綜上所述，本研究初步探討了99Tc－MDP通過miR－338－3p靶向下調(diào)RANKL抑制破骨細胞活性進而緩解骨質疏松發(fā)生可能的分子機制，為后期更深入的探究骨質疏松治療方法提供了新的治療靶點和策略。

圖4 99Tc－MDP通過miR－338－3p靶向下調(diào)RANKL抑制OC細胞增殖及活性 A＆D:qRT－PCR檢測OC細胞中miR－338－3p、CD51和MMP－9 mRNA的表達水平;B:Western blotting檢測OC細胞中RANKL的表達水平;C:CCK－8實驗檢測OC細胞增殖活力。Fig．4 99Tc－MDP inhibited the proliferation and cell activity of OC cells through miR－338－3p targeting and downregulating RANKL