陳武桂 孫靖 李松濤 楊思振 張瑩 胡旭 廖通權 初同偉

陸軍軍醫(yī)大學新橋醫(yī)院骨科，重慶400037

破骨細胞是唯一具有骨吸收活性的多核巨細胞，成熟破骨細胞的鑒定方法主要包括細胞形態(tài)觀察、破骨相關基因檢測、抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)染色及骨侵蝕試驗［1－2］。骨侵蝕試驗是證明破骨細胞是否具有溶骨能力的重要試驗，以往主要通過對動物顱骨、牛骨、牙槽骨等進行切片、打磨、消毒等多道工序后獲得骨磨片，消毒后與破骨細胞共培養(yǎng)然后利用掃描電鏡或者甲苯胺藍染色對骨陷窩進行觀察分析［2－4］。破骨細胞在骨磨片上產(chǎn)生的骨陷窩數(shù)量及骨陷窩面積，直接反映破骨細胞溶骨能力。但是在實際應用中該方法存在較多局限性:首先，骨材料來源困難，制作要求高(需要硬組織切片機、超聲清洗器等)，并且即使經(jīng)過細致打磨后的骨磨片仍可能因骨小梁、骨單位存在厚度不均勻等原因導致破骨細胞黏附不均或粘附性差，影響骨陷窩的形成與進一步觀察。其次，骨片上形成的骨陷窩需要借助掃描電鏡觀察分析，檢測方法復雜、費時;在標準圖片可見圓形、橢圓形、臘腸形骨陷窩，但是由于骨片平面無法絕對平滑，對形成的骨陷窩常難以進行精確的定量分析。本文擬以RANKL誘導RAW264.7細胞建立破骨細胞分化模型，使用骨基質表面培養(yǎng)板(Corning? Osteo Assay Surface Plate)替代骨磨片行骨陷窩試驗檢測成熟破骨細胞的溶骨能力，系統(tǒng)介紹其使用及檢測方法。

1 材料與方法

1.1 材料

小鼠RAW 264.7細胞(中科院上海細胞典藏庫，上海);高糖DMEM培養(yǎng)基(Gibco，US);胎牛血清(Gibco，US);無EDTA胰酶(Gibco，US);核因子kB受體活化因子配體(RANKL)細胞因子(315－11C，PeproTech，US);抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)染色液(Sigama，Japan);骨基質表面培養(yǎng)板(Corning ? Osteo Assay Surface Plate)(Corning，US);4%多聚甲醛，10%次氯酸鈉，1%甲苯胺藍。

1.2 方法

1.2.1 破骨細胞的培養(yǎng)與傳代:用FBS濃度為10%的高糖型DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)RAW 264.7，每1～2天換液1次，待細胞密度至60%～70%左右即可傳代，傳代比例可為1∶4～1∶6。細胞消化方式:常規(guī)換液后添加適量0.25%無EDTA胰酶37%消化5～10 min，用彎嘴吸管均勻、稍用力吹打即可使細胞脫落，避免暴力。破骨細胞培養(yǎng)傳代詳細方式及注意事項如前所述［5－6］。

1.2.2 破骨細胞的誘導分化:選取狀態(tài)良好的RAW 264.7細胞以104個/cm2密度接種于細胞培養(yǎng)板，正常培養(yǎng)24 h后添加含不同濃度(0、10、25、50、100 ng/mL)RANKL細胞因子的高糖DMEM完全培養(yǎng)基，每2天換液一次直至5～6 d后肉眼可見明顯的多核巨型破骨細胞形成，以抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)染色檢測破骨細胞形成情況。

1.2.3 抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)染色:破骨細胞誘導結束后換液，用PBS沖洗2次后以4%多聚甲醛固定15 min，PBS漂洗3次后添加足量抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)染色液，染色液配置方法參照試劑說明書，37℃避光孵育1 h后以自來水沖洗，干燥后倒置顯微鏡下拍照觀察破骨細胞形成情況。

1.2.4 骨基質表面培養(yǎng)板(Corning? Osteo Assay Surface Plate)的使用方法:本實驗采用24孔骨基質表面培養(yǎng)板(Corning? Osteo Assay Surface Plate)，其具體使用方式可參照說明書。簡要介紹如下:破骨前體細胞接種，誘導方式如前。細胞誘導結束后，PBS漂洗3次，可輕柔吹去部分細胞，添加400 μL/孔10%次氯酸鈉溶液室溫浸泡5～10 min以洗脫黏附細胞，超純水清洗2～3次，可稍用力吹去細胞;1%甲苯胺藍200 μL/孔染色2～4 min，超純水清洗3次至液體清亮，吸干，晾干3～5 min。在普通倒置光學顯微鏡下觀察，可見圓形侵蝕空白，侵蝕區(qū)域呈淡紫色，部分未洗脫細胞呈紫色，照相后可用Image J軟件對侵蝕面積進行量化分析。

1.2.5 ImageJ軟件對侵蝕面積進行量化分析:打開圖片后將圖片轉換8－bit，并調高圖片對比度使侵蝕圓環(huán)輪廓更明顯(圖1 A，圖1B);使用魔棒工具逐一圈出所有侵蝕輪廓，并刪除(Backspace)圈內顏色使輪廓更明顯(圖 1C);使用 Image→adjust→threshold圈定所有侵蝕輪廓(圖1D，圖1E)，必要時可再次調整亮度及對比度，根據(jù)圖片比例設定標尺。

圖1 ImageJ軟件對侵蝕面積進行量化分析步驟詳解Fig．1 Detailed analysis of the erosion area by ImageJ software

1.3 統(tǒng)計學方法

使用SPSS 20.0統(tǒng)計軟件對資料進行統(tǒng)計學分析，實驗數(shù)據(jù)采用(珋x±s)表示，用t檢驗判斷其差異顯著性，組間比較采用方差分析，P＜0.05表明差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結果

小鼠RAW264.7細胞經(jīng)不同濃度的RANKL細胞因子誘導分化5 d后，行TRAP染色，結果如圖2 A所示，隨著RANKL因子濃度的增加，生成的成熟破骨細胞(呈酒紅色，不規(guī)則圓形，細胞核數(shù)目≥3)數(shù)目逐漸增加，但在50 ng/mL及100 ng/mL濃度下破骨細胞的生成數(shù)量未見明顯差別，100 ng/mL濃度下破骨細胞融合面積更大。對成熟破骨細胞數(shù)量進行定量分析時發(fā)現(xiàn)(圖2C)，單位面積內成熟破骨細胞的生成數(shù)量隨RANKL濃度進行性增加，在50 ng/mL濃度下達到巔峰，但各濃度間的成熟破骨細胞的數(shù)量差異并不顯著，在100 ng/mL濃度下數(shù)量甚至還有所下降。

與TRAP染色結果一致，隨著RANKL因子濃度的增加，成熟破骨細胞在骨基質表面培養(yǎng)板上侵蝕的空白面積顯著增加，呈不規(guī)則圓形，在最低濃度(10 ng/mL)下亦可見少量的骨侵蝕形成(圖2B)，而對照組(0 ng/mL)未見骨侵蝕形成。通過Image J軟件對骨侵蝕面積進行定量分析(圖2D)，結果表明隨著RANKL濃度的增加，骨侵蝕面積明顯增加、增大，具有顯著差異，分析結果與TRAP染色結果(圖2 A，圖2C)及肉眼下觀察骨侵蝕形成情況一致，且更加直觀、真實地反映了破骨細胞生成情況。

圖2 TRAP染色及骨基質表面培養(yǎng)板檢測破骨細胞形成與骨侵蝕能力Fig．2 Osteoclast formation and bone erosion were detected by TRAP staining and osteo assay surface plate

3 討論

骨骼系統(tǒng)的穩(wěn)定與功能依賴于破骨細胞介導的骨吸收與成骨細胞介導的骨形成構建的動態(tài)耦合平衡，亦稱為骨重塑。在多種骨骼疾病如骨質疏松、腫瘤骨轉移、關節(jié)炎、強直性脊柱炎等發(fā)病機制中，由于破骨細胞異常激活引起的骨吸收異常增強是重要機制之一，因此破骨細胞分化的機制被廣泛研究，并取得了極大進展［7－10］。建立破骨細胞分化模型是研究破骨細胞分化機制的必要流程。因為破骨細胞為高代謝終末分化細胞，存在體內細胞數(shù)量少、難以分離獲取、無法傳代、生存時間短等特點，因此永生化破骨細胞系無法穩(wěn)定存在。目前破骨細胞的體外培養(yǎng)方法包括原代培養(yǎng)和誘導法［11－12］。原代培養(yǎng)即在無菌環(huán)境通過機械分離動物四肢長骨，沖洗骨髓并收集并純化獲得破骨細胞，但存在取材困難、細胞量少、雜質多等缺點。誘導法即通過獲取、培養(yǎng)、誘導包括從人或動物骨髓、脾臟、外周血等獲得的原代單核細胞，或者誘導成熟的破骨前體細胞株如RAW264.7、FDCP、HL－60、THP－1 等，最終獲得較穩(wěn)定的成熟破骨細胞。通過原代細胞培養(yǎng)誘導破骨細胞雖然較貼近活體情況，但是存在取材困難、細胞量少、重復性差等缺點，而通過細胞株構建破骨細胞分化模型則不存在這些問題。其中使用RANKL誘導RAW264.7細胞分化為成熟破骨細胞是體外研究破骨細胞誘導分化的經(jīng)典模型之一，在骨骼系統(tǒng)疾病、骨代謝等研究中廣泛應用［5，11，13］。

RAW264.7細胞株來源于Abelson小鼠白血病病毒所致的腫瘤，是小鼠源性破骨細胞前體細胞，代表破骨細胞分化的早期階段。相比于原代培養(yǎng)方式，該方法具有以下顯著優(yōu)點:首先，RAW264.7細胞生長迅速，容易培養(yǎng)，可獲得大量均一性細胞，顯著降低了破骨細胞培養(yǎng)的技術難度。其次，這種誘導方法方法成熟，已在大量研究中得到驗證，獲得的破骨細胞數(shù)目比其他分離、純化等方法更多，且均一性好，并且具備破骨細胞吸收骨質、形成骨吸收陷窩的特性，便于開展后續(xù)針對破骨細胞的研究。但在實際實驗中，破骨細胞的培養(yǎng)、誘導、鑒定等仍存在細節(jié)要求，給初學者成功培養(yǎng)、誘導破骨細胞帶來一定困難，在近期諸多文獻中也予以了詳細介紹［5，6，11，13］。

目前成熟破骨細胞的鑒定方法主要包括細胞形態(tài)觀察、破骨相關基因檢測、抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)染色及骨侵蝕試驗［1－2］，但均存在一定局限性。比如檢測破骨細胞表型標志基因抗酒石酸酸性磷酸酶 (tartrate resistantacid phosphatase，TRAP)、金屬蛋白酶－9(matrix metalloproteinase－9，MMP－9)、降鈣素受體(calcitonin receptor，CTR)等，雖然可一定程度反映破骨細胞分化程度，但基因表達具有時限性，與破骨細胞分化時期密切相關。而抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)染色雖然可有效鑒定成熟破骨細胞，但正如本次研究的觀測結果，在高濃度RANKL因子刺激下，成熟破骨細胞晚期可相互融合，以成熟破骨細胞數(shù)量(細胞呈酒紅色，形狀呈不規(guī)則圓形，細胞核數(shù)目≥3)反映破骨細胞分化程度并不精確。以骨磨片行骨侵蝕實驗是目前驗證破骨細胞是否具備溶骨能力的主要實驗，其局限性已在前文闡述。本文詳細介紹了一種以骨基質表面培養(yǎng)板替代骨磨片鑒定成熟破骨細胞溶骨能力的方法。骨基質表面培養(yǎng)板是一種在表面鋪設骨基質凝膠的商品化培養(yǎng)板，表面較光滑，各孔間差異性小，具有均一性，可有效模擬骨表面特性。在與不同濃度RANKL因子誘導的破骨細胞共培養(yǎng)后，可形成與破骨細胞分化程度一致的不規(guī)則侵蝕圓環(huán)，結果直觀。并且便于利用圖像分析軟件進行分析，以侵蝕面積反映破骨細胞分化程度，數(shù)據(jù)具有客觀性。該方法較傳統(tǒng)的檢測方法(骨磨片檢測)，具有操作簡便、檢測方法簡單、性價比高、便于統(tǒng)計分析等優(yōu)點，在破骨細胞研究中具有廣泛的應用價值。